橄榄酸化合物OLA的异源表达及分离纯化开题报告

1. 研究目的与意义

聚酮化合物是结构和功能多样的天然产物，在食品和制药行业中应用广泛。植物来源的多酚，如白藜芦醇或紫杉叶素，被用作膳食补充剂；抗生素红霉素或降胆固醇药物洛伐他汀、阿维菌素等可用于医药农业领域。聚酮化合物橄榄酸（olivetolic acid ,OA）是植物大麻素的主要前体，有治疗神经性疾病和疼痛的潜力。聚酮化合物由聚酮合酶 (polyketide synthases，PKSs)催化合成。

本研究以酿酒酵母工程菌株BJ5464为研究对象，从生防真菌罗伯茨绿僵菌中克隆OA合成基因，并连接到酵母穿梭质粒获得重组质粒，转化BJ5464，筛选得到阳性转化子。对获得的阳性转化子进行发酵，萃取液体发酵产物，使用HPLC检测发酵产物，检测OA异源合成情况，并分离纯化OA化合物。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：本研究以酿酒酵母工程菌株BJ5464为研究对象，从生防真菌罗伯茨绿僵菌中克隆OA合成基因，并连接到酵母穿梭质粒获得重组质粒，转化BJ5464，筛选得到阳性转化子。对获得的阳性转化子进行发酵，萃取液体发酵产物，使用HPLC检测发酵产物，检测OA异源合成情况，并分离纯化OA化合物。

预期目标：检测OA异源合成情况，并分离纯化OA化合物。

3. 研究的方法与步骤

一．酵母异源表达激活双聚酮合酶基因簇

1.pyx176、pyx177、pyx178、pyx187质粒提取试剂盒提取
2.酿酒酵母bj5464感受态的制备
2.1.从pda平板上挑取单菌落至50 mlypd，在30 c下摇床培养过夜。

2.2.取500 μl在50 ml新鲜ypd继续生长，直到od₆₀₀达到0.6左右(6 h左右)。
2.3.将细胞置于50 ml试管中，5000 rpm离心5分钟。

4. 参考文献

[1] 胡春生, 吴祖泽, 张庆林. 聚酮类化合物异源表达研究进展[j]. 生物技术通讯, 2013, 24(04): 573-578.

[2] 刘玫, 马豪, 张晖, 等. 不同来源抗冻蛋白在毕赤酵母中的异源表达[j]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2021, 42(05): 1-11 38.

[3] 段月娇, 薛超友, 卢文玉. 异源表达聚酮类化合物前体的研究进展[j]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(11): 107-114.

5. 计划与进度安排

1、第17周（21-22-1学期）-第3周（2024年12月27日—2024年3月13日）：根据和导师讨论确定的论文题目，大量阅读文献，其中选择10篇以上参考文献（外文1-2篇或以上）进行深入阅读，参照任务书写出开题报告。选择一篇外文（5000字以上，文献内容要结合本研究内容）进行全文翻译;

2、第4周（2024年3月14日—2024年3月20日）：在充分调研文献的基础上，制定实验具体实施计划，进行试验研究的前期准备工作；

3、第5周-第11周（2024年3月21日—2024年5月8 日）：根据任务内容实施试验，包括基因克隆，质粒构建以及酵母转化，橄榄酸化合物的提取，分离纯化等。