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1. 研究目的与意义

l-阿拉伯糖异构酶（l-ai）是微生物糖酵解途径中一种重要的酶，可以将醛糖转化为酮糖的异构酶，它被认为是生产稀有糖类时的一种重要生物催化剂，可以使l-阿拉伯糖转化为l-核酮糖，也可使d-半乳糖转化为d-塔格糖。这两种单糖在食物和制药工业中都表现出卓越的商业价值。

近年来，由于发达国家的肥胖率持续上升，人们对于低能量甜味剂的需求越来越大。目前，各国都在寻找一种没有副作用的甜味剂。其中，d-塔格糖是研究的重心。d-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性因子,因为其甜度与自然特性和蔗糖相似, 并具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能^{[ 1, 2]}，d-塔格糖的制备成为各国研究的重点。然而，d-塔格糖的很多生产方法都面临着高成本以及低效率的问题，现在主要的生产方式是利用l-阿拉伯糖异构酶作为生物催化剂将d- 半乳糖异构为d-塔格糖。此外，为了能够提高产量，通过研究不同的底物来获得高转化率也成为研究的热点课题之一。

随着对l-ai家族新成员的认知，它们有的展现出工业应用的完美潜能。l-ai最适底物为阿拉伯糖，目前主要应用于半乳糖异构化制备塔格糖的工艺中，但存在转化效率低的问题。目前已获得凝结芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶具有一定的半乳糖转化能力，基于分子对接的阿拉伯糖异构酶新型底物筛选和反应特性的研究不仅有利于开发出不同底物特异性的突变酶，还有利于提高塔格糖的转化率，在工业上具有一定潜在应用价值。几年，使用l-ai来生产l-核酮糖以及d-塔格糖的生物生产过程有所进步。同时，合理设计的蛋白质工程技术对提高各种ai的催化特性有很大影响。此外，l-ai晶体结构的发现带来了分子水平上对ai结构的理解以及其催化机制。

2. 国内外研究现状分析

1993年，Cheetham 等发现L-AI能够催化D-半乳糖生成D-塔格糖; 此后的20 年间，通过对不同种类的微生物进行产酶筛选、外源表达和性质表征，学者们已经找到了多种适合D-塔格糖工业化生产的L-AI 酶; 且发现主要具有对D-半乳糖的转化率高、酶的热稳定性好、酶的最适催化pH 偏向于适合工业化生产的酸性条件( pH 在5. 0 ～ 6. 0 之间) 等特点的阿拉伯糖异构酶。

3. 研究的基本内容与计划

本次实验的主要内容是研究不同底物特异性的突变酶对于提高半乳糖亲和力的能力，以及不同突变酶在不同条件下的反应情况以研究最适反应条件。具体研究内容：

2016.1-20.16.3

突变酶F279I的诱导表达及纯化

突变酶F279I对不同底物的选择性

2016.3-2016.5

突变酶F279I不同底物的动力学参数的测定

含有突变酶F279I的重组E.coil由醛糖转化为酮糖的工艺研究

2016.5-2016.6 整理数据，撰写论文，准备答辩

4. 研究创新点

至今为止，已有来源于四十多种途径的AI被发现和研究，他们的特性在酶活力，动力学参数，最适pH及pH稳定性，离子需求这五个方面表现出较大的差异。本次试实验基于阿拉伯糖异构酶催化半乳糖生产塔格糖的反应体系，研究不同底物特异性突变酶对于提高半乳糖亲和力的能力，并最终拓宽底物图谱。