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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义：花青苷广泛的存在于自然界的各种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、预防心血管疾病、预防肥胖和缓解糖尿病等作用。花青苷的结构基因的表达受三种转录因子myb、bhlh和wd40组成的复合物的调控。本研究选取了苏绿一号和mo313这两个不同品种的绿豆，研究其幼茎上与花青苷合成相关的关键基因，找出两者的差异基因并分析，尤其是两者调控基因的区别及其相互作用，以期进一步加深对绿豆中的花青苷合成调控的理解。
国内外研究概况：目前对于花青苷的研究，选用的对象大多是苹果、胡萝卜、蓝莓、葡萄和石榴等这些花青苷含量多的植物，研究的关注点也聚焦在花青苷的产量及其着色机制上。植物花青苷的合成代谢途径是黄酮类化合物代谢途径的链之一[1]。影响植物花青苷合成以及代谢相关的酶类的基因包括结构基因和调节基因这两大类，结构基因编码合成代谢相关的酶类，直接参与花青苷的合成，调节基因通过其表达的蛋白调控结构基因的表达强度与表达模式[2]。花青苷的合成代谢途径中的相关结构基因有查尔酮合成酶chs、黄烷酮羟化酶f3h、二氢黄酮醇还原酶dfr、查尔酮异构酶chi、花色素合成酶ans、类黄酮糖基转移酶ufgt和类黄酮3'羟化酶f3'h[3]。miyako等[4]研究表明，与花青苷合成含量显著相关的转录因子是r2r3-myb蛋白、myc家族的bhlh蛋白和wd40蛋白。这些调控蛋白形成一个三元myb-bhlh-wd40(mbw)转录复合体，其结合靶基因中的启动子并激活或抑制花青素途径中结构基因的转录。
应用前景：花青苷的着色是绿豆的重要性状之一，它被用作一种形态标记来确定品种的纯度和辅助育种选择[5]。目前的研究结果表明绿豆的幼茎花青苷显色由单基因调控，但此方向的研究较少，所以本课题能明确花青苷合成途径中的关键基因，还可以加深对mbw 转录复合体在调控花青苷合成进程中存在的网络联系机制的研究。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：植物花青苷的生物合成是一个极其复杂的过程，其内在的结构、调节基因和外部环境影响因素及其相互作用均对植物的各器官花青苷着色产生影响，且对各个器官的影响可能不同。目前的研究结果明确表明绿豆的幼茎花青苷显色由单基因调控，但其调控的分子基础尚不清楚。本课题旨在研究出不同品种的绿豆中花青苷合成的调控基因及合成途径关键基因的差异。
研究内容：培育两个不同品种的绿豆，选取不同时期的两种绿豆幼茎，测量花青苷含量，进行对比。从幼茎中分离出rna，进行差异表达分析，通过定量pcr（qrt-pcr）对花青苷合成的相关基因进行验证。在绿豆幼茎花青苷差异的遗传基础上，利用定位群体进行定位，分析这两种绿豆中花青苷调控基因及合成途径关键基因差异。
拟解决的关键问题： 虽然在花青苷的合成途径中，myb、bhlh 和 wd40 三类转录因子起主要作用，但绿豆幼茎花青苷的生物合成过是如何被调控的尚不清楚，。另外，植物花青苷的生物合成可能同时还受到光照、温度、激素和病原感染等多种外界因素的影响。
3. 研究的方法与方案
本实验选取苏绿一号和mo313这两种绿豆种子，对种子进行消毒（用10 % h2o2浸泡种子10-15分钟，来回颠倒几下，用去离子水冲洗干净）、发苗（种子放入盛有滤纸的培养皿中，加入去离子水浸泡种子，放入温箱培养8-10小时），将发好苗的种子移入培养土中，按时浇水。
绿豆发芽后，选取早期的一个时间点开始取下胚轴的样，之后每隔12小时取一次样，最后一次加上绿豆上胚轴的样，测定花青苷含量。称取0.8 g鲜样放入8 ml 1 % hcl-甲醇溶液中，于室温黑暗中浸提12小时。用分光光度计测定提取液在553和660处的吸光值，二者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01定义为一个单位u。设置3个重复。花青苷含量的单位最后用u·g-1fw表示。
对绿豆幼茎的下胚轴进行采样，置于-80℃的环境下保存，用液氮研磨，提取rna，反转录成cdna，通过定量pcr（qrt-pcr）对花青苷合成的相关基因调控基因和结构基因进行验证。
4. 研究创新点
此前对于花青苷的研究，选用的对象大多是苹果、胡萝卜、蓝莓、葡萄和石榴等这些花青苷含量多的植物，研究的关注点也聚焦在花青苷的产量及其着色机制上。随着分子生物学技术的发展，与花青素生物合成有关的基因也在部分植物中陆续克隆获得，而调节基因的调控机制仍是当前的研究热点。有研究表明，不同植物的花青素合成过程中关键酶基因的表达涉及多种调控因子，且调控因子调控的关键酶基因也不尽相同。在拟南芥、金鱼草中转录因子的克隆比较多，在绿豆中研究的还比较少。转录因子间如何相互作用并共同调节花青苷的合成机制目前还是不很清晰，有待于进一步研究。本课选用了两种绿豆，研究其幼茎上花青苷的合成途径，分析这两种绿豆中花青苷调控基因和结构基因的区别。
5. 研究计划与进展
本课题的研究计划为三月份完成绿豆幼茎花青苷含量的测定，并对绿豆幼茎和绿豆幼茎花青苷提取物进行对比、拍照；四五月份提取出绿豆下胚轴中的RNA，进行差异表达分析，通过定量PCR（qRT-PCR）对花青苷合成的相关基因进行验证，分析出这两种绿豆中花青苷调控基因的区别。
目前的进展为已经种了三批绿豆：第一批由于缺少经验，绿豆幼茎生长较弱，提取出绿豆下胚轴的花青苷进行测量作为练手；第二批首次采样过迟，每隔12小时取一次样，测量花青苷的含量；第三批首次采样时间合适，但整体绿豆长势不佳。接下来几批的绿豆可采用时间梯度播种，以12小时为间隔播种，最后一起采样，对两种绿豆幼茎进行拍照对比，并且拍下花青苷提取液的颜色对比，最后测量花青苷的含量。
