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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题意义： 沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，是一种肠杆菌中的兼性厌氧菌。能产生非水溶性黄、紫和红色素的革兰氏阴性小杆菌。一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。粘质沙雷氏菌能产生红色灵菌红素，灵菌红素具有多种生物活性，例如抗癌，抗霉，免疫抑制等。 乙酰基转移酶（acyltransferase）是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶。蛋白质的乙酰化修饰有两种类型，一种是N末端乙酰化（Nα-乙酰化），此类修饰是将乙酰基供体的乙酰基团转移到蛋白质的N末端的氨基基团上；另一种乙酰化修饰是将乙酰基团转移到赖氨酸侧链氨ε氨基基团上（Nε-乙酰化）。氨基糖苷类抗生素N-乙酰转移酶(AAC)，主要以乙酰辅酶A 作为乙酰基的供体, 分别作用于氨基糖苷类抗生素的2-脱氧链霉胺环的1位和3 位以及6 -氨基己糖环的2 ‘位和6 ‘位。分AAC(2 ), AAC (6 ‘), AAC (9 ), AAC (3 )4 种[1]。细菌通过AAC对氨基糖苷类的修饰，使氨基糖苷类抗生素钝化，表现出对氨基糖苷类抗生素的耐药性。 随着生命科学在分子水平上的不断深入的研究，各种生命现象也更为人们所熟知。而酰基转移酶的酰基化等作用在生命现象中的重要性也必将更为人们所重视。本实验采用分子生物学技术，将沙雷氏菌(Serratia sp.)FS14中乙酰基转移酶（05790和16185）的目的基因用PCR技术扩增，把所获目的片段转入表达载体，并将载体转入粘质沙雷氏菌FS14和大肠杆菌C43中进行表达，将表达产物进行纯化。获得有活性的目的蛋白，最后进行初步的结晶条件筛选，为明确乙酰转移酶的结构与功能奠定了基础。 国内外研究概况： 乙酰转移酶对细菌的毒力作用： 多项研究表明，蛋白质乙酰化在调节细菌毒性方面具有意想不到的作用。 乙酰化与毒力之间关系的直接证据来自沙门氏菌pat 缺失突变体的毒力表型[6]。与野生型相比，pat缺失突变体在小鼠中的毒力有所减弱。HilD是一种乙酰化蛋白,乙酰化可通过Spi1的关键转录调控因子HilD介导。在鼠伤寒沙门菌中hila可以正向调控Spi1的表达，而HilD可以间接调控Spi1和Spi2的表达，且hild位于hila的上游[2]。 此外，Pat乙酰化HilD可以维持HilD的稳定性，这对于Spi1的活化至关重要。赖氨酸297 (K297)位于HilD的螺旋中，是Pat的底物残基。K297的乙酰化增加了HilD的稳定性，但降低了其与DNA结合的亲和力。在低氧高盐诱导条件下，K297的乙酰化水平下调。在小鼠中，乙酰化的K297与去乙酰化的K297相比，引起对HeLa细胞的侵袭减弱，毒性减弱，说明去乙酰化的K297对沙门氏菌的毒性至关重要。K297的乙酰化调控HilD的蛋白稳定性和结合DNA的能力，这种调控机制维持了细胞中HilD的含量和活性，因为大量的HilD不利于细菌生长，而HilD适当的去乙酰化则保证了其对细菌致病性的DNA结合活性。 |
| 双组分系统（TCSs, Two - Component Systems）是细菌最重要的信息传递系统，它能将细菌外部的不利环境条件，翻译成化学信号并传递至胞内，使细菌能及时调整自身状态以适应恶劣的生存环境[3]。 PhoP-PhoQ双组份系统的活性受乙酰转移酶乙酰化的调控，进而影响着某些细菌的毒力作用。 以沙门氏菌为例，PhoP-PhoQ可调节沙门菌对Mg2 及其他周质环境的适应性，调控毒力基因的转录和表达，在沙门菌毒力调控中发挥重要作用[4]。PhoP和PhoQ蛋白是许多基因表达所必需的，其中一些基因，如pagC，与毒性有关。由PhoP调控的PagC是伤寒沙门氏菌中一个18kDa的外膜蛋白，已经被证明对培养的巨噬细胞中的伤寒链球菌的存活和毒性是必需的[7]。在1989年，发现S.Typhimurium的phoP基因突变体被认为是一种潜在的疫苗，因为它是无毒的，并且仍能够诱导免疫应答[8]。据报道，活结核分支杆菌phoP突变体在重症联合免疫缺陷病（SCID）小鼠中比BCG菌株有更大的减毒性，表明依赖pat的乙酰化显著调节PhoP的活性，并可利用该方式扰乱细菌的代谢生长[9]。 乙酰转移酶影响细菌的耐药性： 近年来，研究发现，细菌可以产生多种修饰酶，共价修饰氨基糖苷类抗生素特定的氨基或者羟基基团，干扰抗生素和核糖体的结合，从而使细菌对抗生素产生耐药性。 氨基糖苷类抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，随着抗菌药物在临床上的广泛应用，某些细菌对常用抗菌药物出现了不同程度的耐药，并且其耐药性日趋严重。目前，导致细菌产生抗药性的因素很多，如细胞膜通透性的减低、细胞主动外排药物、作用靶点的改变等。 氨基糖苷类抗生素钝化酶是细菌对氨基糖苷类抗生素耐药最主要的原因之一，它们对分子中特定氨基和羟基的化学修饰使修饰后的药物与细菌核糖体的结合能力大大降低，是细菌产生严重的耐药现象的原因之一[3]。 乙酰转移酶与人体健康： 近几十年来，随着世界环境污染的加剧和饮食内容的日益丰富，来自环境和饮食中的致癌物质对人类DNA的不良作用日益收到学者们的注意，致癌原物质在人体内的代谢以及其与代谢过程相关密切的多种代谢酶在癌症发生中的作用已经成为中外学者研究的焦点。N-乙酰基转移酶作为一个二相代谢酶，在芳香胺和杂环胺类物质的代谢过程中起着重要的作用。 目前，在NAT领域的研究主要集中在NAT2上，国内外关于NAT2多态性与疾病的发生已有大量的研究[10]，证明了膀胱癌、结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤在不同类型乙酰化代谢者NAT2活性在人群中呈多态分布，根据乙酰化表型的不同可将人群划分为三类：慢型乙酰化代谢者、快型乙酰化代谢者和中间型乙酰化代谢者，它们发生的频率不同[5]，并存在人种差异。 |
| 应用前景： 因各种耐药细菌的出现和蔓延,亟需开辟新的抗感染途径。抗细菌毒力靶向药物能选择性地遏制目标菌的不同毒力因子，并不直接影响菌体的存亡,能有效降低细菌耐药,弥补了现行抗感染药物的不足,是研发抗感染新药的重要途径。蛋白质乙酰化是在真核生物和原核生物中普遍存在的翻译后修饰，该过程可以通过蛋白质乙酰转移酶酶促反应实现。蛋白质的乙酰化在细菌的代谢、抗药性、毒力和其他的一些细菌活动中起着重要的作用。最近越来越多的证据表明，通过乙酰转移酶的乙酰化作用，可能影响着细菌的毒力作用，并且对细菌抗氨基糖苷类抗生素的作用产生一定影响。 蛋白质的乙酰化是调节蛋白质功能的常见修饰，并且有几种机制可以控制该过程。在细菌中，乙酰化主要由特定的乙酰转移酶催化。细菌中的乙酰化研究重要集中于少数微生物（如大肠杆菌、沙门氏菌等），限制了对于乙酰化和毒力作用的研究，在其他病原体中做更多的研究将有助于理解乙酰化在细菌毒力中的作用。 自1940年发现青霉素以来，不同种类的抗生素被不断地开发出来并用于各种疾病的临床治疗，由于抗生素的大量使用，细菌逐渐产生了抗药性。但是随着时间的流逝，抗生素的开发也越来越艰难，无法抵抗细菌的抗药性。氨基糖苷类抗生素作用范围广泛，效果好，被广泛用于革兰氏阴性细菌引起的疾病的治疗，而乙酰转移酶对氨基糖苷类抗生素的修饰作用，是使氨基糖苷类抗生素钝化的原因之一。因此，通过对乙酰转移酶修饰氨基糖苷类抗生素的研究，可以更好的解决细菌耐药性的问题，对控制传染性疾病的肆虐、保护人类生命健康有着举足轻重的地位。 参考文献 [1] 徐艳, 郭丽双, 付英梅, et al. 细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制[J]. 中国微生态学杂志, 2008, 20(2)191-192. [2] 刘子健, 陈韵, 李扬, et al. 肠炎沙门菌调控基因hilD与hilA的体外表达规律研究[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版, 2016, 37(4)5-8. [3] 郑卫. 氨基糖苷类抗生素研究的新进展[J]. 国外医药抗生素分册, 2005, 26(3)178-179. [4] 陈嘉瑜, 蔡霞, 瞿涤. 沙门菌PhoP-PhoQ双组分信号转导系统[J]. 微生物与感染, 2010, 05(4)239-242. [5] 何路军等.国外医学输血及血液学分册,2003,26(6)529-531 [6] Sang Y , Ren J , Ni J , et al. Protein acetylation is involvedin\r,Salmonella enterica\r, serovar Typhimurium virulence[J]. Journalof Infectious Diseases, 2016jiw028. [7] Heffernan E J . The Salmonella typhimurium virulence plascomplement resistance gene rck is homologous to a family of virulence-relatedouter membrane protein genes, including pagCail.[J]. Journal ofBacteriology, 1992, 174(1)84-91. [8] Galán, Jge E,Curtiss R . Virulencevaccine potential of phoP mutants of Salmonellatyphimurium[J]. Microbial Pathogenesis, 1989, 6(6)433-443. [9] Ren J , Sang Y ,Lu J , et al. Protein AcetylationIts Role in Bacterial Virulence[J].Trends in Microbiology, 2017S0966842X17300732. [10] Hein DW et al.Mutat Res,2002,50665-77 |
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
将沙雷氏菌中的两个乙酰基转移酶05790和16185表达纯化并对其结晶条件进行筛选
研究内容：
3. 研究的方法与方案
技术路线：
pcr获取目的基因→目的基因连接表达载体→重组质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞→挑取正确转化子提取质粒并鉴定正确的重组质粒→转化正确的质粒至野生型fs14中→诱导表达→表达优化→分离纯化→获得有活性的目的蛋白 →结晶条件的初步筛选
实验方案：
4. 研究创新点
本实验对象选取两个沙雷氏菌里的酰基转移酶，通过筛选，得到含有该酰基转移酶的菌株，研究其在本体中的过表达情况，获得目的蛋白后初步探究其结晶条件，为晶体学结构研究奠定基础。
在技术研究上，涉及微生物学、分子生物学等学科知识，体现了交叉学科研究特点。
5. 研究计划与进展
2018年10月-2018年12月，查阅资料、文献；学习和熟悉基本实验操作。
2019年1月-2019年3月，乙酰基转移酶05790和16185基因的过表达。
2019年3月-2019年4月，对酰基转移酶的分离纯化与结晶条件初筛。
