美洲商陆耐锰、镉的生理机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题的意义

重金属是广泛存在于环境中的有毒有害污染物，在矿区中存在的有害重金属浓度更高。不同矿区尾矿中有害重金属的浓度不同，其有机质、氮、磷的含量均很低，大概只有正常植被覆盖土壤平均背景值的20%~30%^【1】。矿产资源的开发利用所造成的土壤重金属污染由地球化学链、食物链进入生物体，给矿山及其周边地区居民的食品安全、生态安全甚至社会和谐带来严重隐患，因此对矿区污染土壤的生态恢复就显得十分重要^【2】。而生态的恢复可以利用植物对重金属的吸收从而改善土壤中有害重金属含量。故对不同植物进行耐重金属性生理机制研究至关重要。不同的植物对不同重金属的耐性强弱及生理机制也不同。鉴于植物对于耐重金属性存在着多种生理机制，本实验就围绕其中一种植物美洲商陆（phytolacca americana）研究其对镉、锰等重金属的积累能力，讨论美洲商陆耐重金属性生理生化机制的影响因素，欲为采用矿区植物对重金属污染土壤的修复提供理论依据并且希望能对重金属污染土壤修复中植物的选择提供相应依据。

1.1国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

2 研究的目标、内容和拟解决的关键问题

2．1研究目标

希望能够通过研究其重金属胁迫下相关的生理指标，明确美洲商陆重金属积累的特性，为日后研究镉、锰的主要结合配体种类及其代谢调节过程，研究美洲商陆积累和耐受重金属胁迫的机理以及将来提高美洲商陆积累和耐受重金属能力的分子改造提供理论基础。

3. 研究的方法与方案

3研究方法：

3.1材料选择

选择湖南吉首(JS)美洲商陆种群进行转录组实验

3.2处理方法

本实验室采集湖南吉首的种子，先干燥处理，再去除瘪粒、霉粒，挑选出饱满优质的种子。合格的种子在浓硫酸中浸泡20min，用水冲洗种子。将美洲商陆种子播种在蛭石基质上发芽，待幼苗长至2片子叶全部打开时，选取长势和大小一致的幼苗，将其移栽到1L的塑料杯中，每个塑料杯种3株美洲商陆。开始时在去离子水中预培养2天，然后使用1/8 Hoagland营养液培养，再逐步换为1/4、1/2和完全Hoagland培养液。每2天换一次培养液，并用HCl或NaOH溶液将营养液pH调至5.2。Hoagland营养液中具体成分为：2.5mM Ca(NO₃)2、2.5mM KNO₃、l.0mM MgSO₄、0.5mM KH₂PO₄、20μM Fe-EDTA、46μM H₃BO₃、0.32μM CuSO₄、0.71μM ZnSO₄、11.1μM MnCl₂、0.38μM H₂MoO₄。

美洲商陆幼苗长至4叶1心期（不包括子叶）时，开始处理，处理浓度分别为Control、20 mmol L^-1 Mn、50 μmol L^-1 Cd。Mn和Cd分别以MnCl₂母液和CdCl₂母液的形式添加到Hoagland营养液中。对照为Hoagland营养液，每2天换一次处理液，处理20d。

处理结束收苗时，先将美洲商陆幼苗用去离子水冲洗，再将根系浸泡在NaCl溶液中，用去离子水冲洗几次，然后用吸水纸将表面的水分吸除。分别测量株高，根长，鲜重等形态指标，测定根长时以最长的主根为准。取样时采集成熟叶片的倒三叶，用锡箔纸包裹并放入液氮中冷却，最后放入-80℃冰箱中保存。

3.3形态指标测定

取一定量的美洲商陆分别测量处理组和对照组的株高、地上部鲜重、地下部鲜重、根长、叶片数量、叶宽、叶长

3.4光合指标测定

3.4.1光合色素含量测定

参照Arnon（1949）方法。取处理15天的植物倒三叶0.1g，加入10ml乙醇：丙酮（1:1）避光浸泡过夜，在663、645、470nm波长处测定吸光度。根据丙酮法公式计算叶绿素a、b和类胡萝卜素含量。

3.4.2荧光参数测定

材料处理第15天，暗适应1小时，采用PAM-210（Walz,Germany）测定叶绿素荧光参数。测定用调制光、作用光、饱和脉冲光分别为0.07、210、6000μmol m^-2s^-1

3.5硫代巴比妥酸反应物（TBARS）分析

TBARS测定参照（Hodges et al.,1999）方法。取处理15天的植物鲜样用80％乙醇研磨，3000g离心10分钟，取1ml上清液加1 TBA：1ml 0.65％丁基羟基甲苯（TBA）（溶于20％TCA含0.01％TBA）；2-TBA：1ml20％TCA。混匀，95C水浴25min，冷却，离心。上清测定440、532nm、600nm吸光值。用下列公式计算MDA含量：

1）[(A_{532 TBA}-A_{600 TBA})]-[(A_532-TBA-A_600-TBA)]=A

2）[(A_{400 TBA}-A_{600 TBA}) 0.0571]=B

3）[MDA equivalents(nmol ml^-1)]=(A-B/157000) 10⁶

3.6过氧化氢的测定

运用KI法，加入定量KBr，用盐酸酸化，加入KI，立即水封，阴暗处反应一段时间 用标准硫代硫酸钠滴定至浅黄色后 滴加可溶性淀粉溶液，以蓝色退去为滴定终点（1）2Br^- H₂O₂ 2H =Br₂ 2H₂O

（2）Br₂ 2I^-=2Br I₂

（3）2Na₂S₂O₃ I₂= Na₂S₄O₆ 2NaI

过量的Mn2 会提高机体内的氧化还原电位，这是因为Mn² 在叶绿体中可被氧化为Mn^{3 ，}因此，过氧化物会大量累积。

3.7可溶性糖测定

蒽酮比色法，先称取一定量的叶片提取可溶性糖，再绘制标准曲线进行比色，最后通过公式得到可溶性糖含量。

3.8重金属含量分析

镉、锰含量用Zhao等（1994）方法。植物样品烘干，研磨过60目的筛子，准确称取0.1000g用HNO₃:HCLO₄（87:13）消煮，2.5％HNO₃定容，用NovAA400原子吸收分光光度计测定镉、锰含量。同时反映重金属Mn和Cd毒害引起变化的元素如铁、镁等浓度。

4技术路线：

5实验方案：

5.1材料

2016年10月开始培育美洲商陆，美洲商陆幼苗长至4叶1心期（不包括子叶）时，开始处理，处理浓度分别为Control、20 mmol L^-1 Mn、50 μmol L^-1 Cd。Mn和Cd分别以MnCl₂母液和CdCl₂母液的形式添加到Hoagland营养液中。对照为Hoagland营养液，每2天换一次处理液，处理20d。

处理结束收苗时，先将美洲商陆幼苗用去离子水冲洗，再将根系浸泡在NaCl溶液中，用去离子水冲洗几次，然后用吸水纸将表面的水分吸除。分别测量株高，根长，鲜重等形态指标，测定根长时以最长的主根为准。取样时采集成熟叶片的倒三叶，用锡箔纸包裹并放入液氮中冷却，最后放入-80℃冰箱中保存。

5.2处理

在2016年2月开始做实验，分别收取根、茎和叶，在2月完成测定形态指标，并制备后续所需的相关试剂。2017年3月及4月测定光合指标、丙二醛测定、过氧化氢、可溶性糖以及重金属含量。具体测定方法见研究方法。

5,3分析数据

2017年5月已应收集大量数据，将测定的结果用excel进行记录统计，用SPSS13.0软件统计差异显著性，分析测定的数据中每个指标是否存在关联，比如重金属含量与地上部地下部鲜重有何联系，或是观测在重金属胁迫下各种形态指标的差异分析重金属胁迫的影响。

5.4 总结 2017年5月应得出相应结论。

6可行性分析：

植物本身为超积累植物，故在之前的研究以表明美洲商陆对镉、锰的吸收有较为显著的吸收效果，故本次实验是在已有基础上对其耐重金属机制的生理机制的研究，在重金属胁迫下，应会看到对美洲商陆产生的相应的影响。同时分析其生理机制也就更为可行。另外本实验室的仪器设备均较为完好先进，实验器材与试剂准备充分，从理论上足以完成实验。

4. 研究创新点

7 特色或创新之处

本次实验预计测定的生理指标较为全面，除了重金属含量还与生理形态、叶绿素等多个方面综合考虑测定，就单一一个种群进行试验可以更加精准的分析针对这一种群的相关重金属胁迫因素及影响，有利于为其他植物材料做相关耐重金属性生理机制的研究。

5. 研究计划与进展

8 研究计划及预期进展

2016年9月开始培育美洲商陆

2016年12月开始做实验，分别收取根、茎和叶，完成测定形态指标。