1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 本课题研究意义
1．1 选题依据
全球的土地盐渍化十分严重，其土壤含盐量超过0.3%，因此许多植物由于土壤问题也受到影响，盐胁迫是一种主要的非生物胁迫，严重限制作物的生长和产量，是全世界农业的一个日益严重的问题[1-4]。在盐胁迫的条件下，植物体内会产生很多自身不需要的有机酸，并从植物根部分泌出去，与植物根部的碱进行中和反应，从而减少了植物根部对于碱性离子的吸收。盐胁迫可引起活性氧（ros）离子的应激，渗透胁迫，营养不平衡和氧化应激，并可诱导几种形态的生理和代谢反应[5-7]。盐胁迫导致离子含量如na 和cl-的增加，以及细胞ros水平的增加，例如o2-和h2o2。这些盐和ros可以通过加剧膜脂质过氧化作用，破坏细胞膜通透性以及植株的生理过程，特别是能够通过光合作用来抑制植物生长[5,8,9]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目的
二氢卟吩铁（dhfe）是一种新型的植物调节剂，是以焦脱镁叶绿酸、紫红素、二氢卟吩为主配体，不同酸根或氢氧根为轴向配体（x）与过渡金属三价铁离子螯合的二氢卟吩铁（iii）螯合物。其中叶绿酸具有抗氧化和清除活性氧自由基的功能，被认为是叶绿素的衍生物，能抑制各种化学品的突变性,并且具有抗氧化和清除自由基的功能，促进植物生根。另外，叶绿酸卟吩环络合的镁由其他过渡金属取代的叶绿酸金属衍生物，如叶绿酸铜、铁、钴、锌等分子在电荷、电子密度、轨道能量及分子理化性质等方面与叶绿酸皆存在差异，具有更强的抗菌、抗病毒、抗贫血以及抗氧化作用[11]。
本实验以耐盐性不同的栽培大豆lee68品种（耐盐性强）和jackson品种（耐盐性弱）大豆为实验材料，探究对其幼苗叶片喷施不同浓度的dhfe，对nacl胁迫下两品种大豆生理形态（如株高、鲜重、干重）、光合参数、抗氧化酶系活性等生理指标的影响，为dhfe作为植物生长和耐逆调节剂在大豆等作物的耐逆性化学调控和盐渍地区种植实践利用提供重要理论依据和实践指导。
3. 研究的方法与方案
研究方法
1、首先选择健康的Lee68品种Jackson品种的种子，消毒后让其发芽，发芽后将大豆转移到含有蛭石以及Hoagland培养液的塑料盆中培养。待大豆幼苗长出第一个三出复叶时，就开始将其分组，分别是：第一组连续地在1/2 Hoagland氏溶液中生长，并用去离子水（对照）喷雾；第二组用1 / 2 Hoagland的溶液培养，并用0.01mg/kg DHFe喷雾；第三组用1/2 Hoagland加120mmol/L NaCl的溶液培养，并用去离子水喷雾；第四组用1/2 Hoagland加120mmol/L NaCl溶液培养，并用0.01mg/kg DHFe喷雾。
2、培养10天后，等到大豆幼苗的三出复叶各个组间有明显的变化时，就可以开始测植株的各项生理指标。分别是幼苗的鲜重及干重，光合参数以及抗氧化酶活性（APX，CAT，SOD和 POD）。
技术路线
实验方案
1、 培养盐胁迫大豆苗并喷施二氢卟吩铁
（1）选择健康的Lee68品种Jackson品种的种子，并用75％（v / v）乙醇表面灭菌5分钟，随后用蒸馏水洗涤几次。然后将种子放在蒸馏水中浸泡5小时，播种在含有两层滤纸的培养皿中，并在251℃下在黑暗中发芽。将发芽的种子种植在包含蛭石的塑料盆（11cm深，9cm直径）中，并覆盖约1cm蛭石的深度。将种子转移到填充有1/2的蛭石的塑料矩形容器（3524cm） Hoagland的营养溶液，并保持在温室中。 温室温度保持在252/182℃（白天/夜晚），光周期为约14h / 10h（白天/夜晚）。
（2）当大豆幼苗生长直至有三出复叶时，将它们随机分成四组。第一组连续地在1/2 Hoagland氏溶液中生长，并用去离子水（对照）喷雾；第二组用1 / 2 Hoagland的溶液培养，并用0.01mg/kgDHFe喷雾；第三组用1/2 Hoagland加120mmol L-1 NaCl的溶液培养，并用去离子水喷雾；第四组用1/2 Hoagland加120mmol L -1 NaCl溶液培养，并用0.01mg /kg DHFe喷雾。上述喷雾处理（每次15mL）在下午进行，每隔一天重复。 每3天更新培养液，14d后，分析植物的株高、叶片的鲜重与干重、光合参数、和抗氧化酶活性（APX，CAT，SOD和 POD）。
2、生理指标的测定方法
（1）表型观察和形态指标测定、比较
将喷施DHFe溶液的大豆幼苗培养至有明显现象时，进行拍照观察。随机选取10株新鲜植株，进行根长、株高的测量，洗净、拭干后，分别称取地上部和根部及整株鲜重。再将新鲜的地上部和根部及整株放入称量瓶中，放置105℃烘箱烘干至恒重，算的植株的失水率。
（2）光合参数测定
净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度 (Ci)、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）测定前将试验材料置于强光下照射1 h，使叶片气孔经强光诱导充分张开后，使用LI-6400型便携式光合仪（LI-COR Inc，USA）测定其各项指标。内置光源强度为800molm-2s-1，温度为30℃，大气CO2浓度约350 mmolmol-1[22]。
（3）叶片SOD、CAT、POD和APX活性测定
加入0.1mol/ L磷酸缓冲液(pH 7.0) 100mL，20mmol/L EDTANa2 10mL和10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用去离子水定容至200 mL，摇匀，即为酶提取缓冲液。称取0.2g样品，置于研钵中，加入2mL酶提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入至离心管中，于4℃，12000 g离心15 min，收集上清液并测量总体积，做为酶提取液低温保存备用。
抗坏血酸过氧化氢酶（APX）活性测定，加入1.5ml 0.1M PBS（pH7.0），15μL100mM AsA，15μL30% H2O2，去离子水1.42ml，和50μL酶提取液，组成3ml混合体系。以每分钟内OD290值变化0.01为1个APX活性单位[23]。
过氧化氢酶（CAT）活性测定依据方法[24]，取1.5ml 0.1M PBS（pH7.0）, 5μl 30% H2O2，1.445ml去离子水和50μL 酶液，测其1min内在240nm下H2O2的降低值，以每分钟内OD240值变化0.1为1个酶活性单位。
过氧化物酶（POD）活性测定，参照方法有改动[25]。取1.85ml 0.1M 醋酸钠缓冲液（pH5.4），1ml 0.25%愈创木酚，50μL 0.75% H2O2 和100ML酶液，组成3ml体系。测其在470nm下1min 之内的变化值。用每min内A470变化0.1为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。
超氧化物歧化酶（SOD, EC 1.15.1.1）活性测定用NBT法有改动[26]。1.5ml 0.1mol/L PBS（pH7.8），0.3ml 130 mM Met，0.3ml 750 μM NBT, 0.3ml 20μM 核黄素, 15μl 1 mM EDTANa2，505μL去离子水和80μL酶液组成3ml体系。反应混合液在5000Ix条件下反应15min，测其560nm吸光值，以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位计算SOD活性。
可行性分析
已有研究表明即使很低浓度的叶绿酸，对线粒体都具有很好的保护作用。另外，叶绿酸卟吩环络合的镁由其他过渡金属取代的叶绿酸金属衍生物，如叶绿酸铜、铁、钴、锌等分子在电荷、电子密度、轨道能量及分子理化性质等方面与叶绿酸皆存在差异，具有更强的抗菌、抗病毒、抗贫血以及抗氧化作用。因此根据所查阅的文献阅读，以及国内外学者的研究表明，二氢卟吩铁是具有一定程度的缓解盐胁迫的能力。因此本实验需要对其进行研究是可行的。
4. 研究创新点
特色或创新之处
虽然如今对二氢卟吩铁的研究已有不少，但是对植物进行喷施二氢卟吩铁的研究尚未见报道。因此本实验的研究方向比较新颖，若如成功，将又有一种化学调控的方法可以缓解植物的盐胁迫。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2016年10月～2016年12月：熟悉实验室环境，查阅相关文献。
2016年12月～2017年03月：完成文献综述和开题报告，预备实验和部分正式实验。
