gga-miR135 和gga-miR124基因表达载体的构建开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：

禽流感病毒属于 a 型流感病毒，可感染多种宿主，包括人、禽类、猪、狗和马等，其频繁爆发给我国乃至世界上许多国家的养禽业造成了极大的经济损失^{[1, 3]}。禽流感病毒致病性主要取决于宿主的免疫应答，树突状细胞（dendritic cells，dcs）是宿主免疫应答反应中最重要的抗原识别和递呈细胞，时刻监视病原微生物的入侵，构成了机体黏膜免疫的第一道防线。dcs在免疫应答过程中具有双重调节作用，既可以分泌大量细胞因子（如il-1，ifn-ɑ等）调控天然免疫应答^{[4, 5]}；也可以主动伸出树突摄取和识别病原微生物，经加工处理后呈递给附近的淋巴细胞诱导获得性免疫应答^{[6, 7]}。近年来，随着树突状细胞的研究白热化，大量证据显示mirna也参与了dc发育及功能的调控。所以通过人工合成所需的表达载体，导入机体中，人工合成的载体表达目的基因，合成促进免疫表达相关的mirna，从而调控dc。

[1] shi y, wu y, zhang w, qi j, gao gf. enabling the host jump structural determinants of recept-binding specificity in influenza a viruses. nat rev microbiol. 2014;12822-31.

2. 研究的基本内容和问题

禽流感是由正粘病毒科a型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局列为a类烈性传染病。目前我国主要采用肌肉注射灭活禽流感病毒疫苗加以预防。但在生产实践中往往出现中和抗体效价高、强应激等问题。

黏膜是禽流感病毒的主要入口，如果在粘膜处建立起有效的免疫保护体系，将会控制该病的传播。树突状细胞在黏膜免疫系统中起关键性的作用，是唯一能激活幼稚型t细胞免疫应答的抗原递呈细胞，能通过模式识别受体（pprs）识别病原体及其他微生物，将抗原加工处理后递呈给淋巴细胞，并分泌各种不同的细胞因子促进淋巴细胞的增殖和分化，诱导高效的免疫应答。

本研究旨在构建能够刺激树突细胞产生相应免疫效应的枯草芽孢杆菌的表达载体，通过overlappcr这一技术，将三条目的片段连接在一起，并成功导入载体中，使其表达，从而刺激树突细胞产生相应的免疫应答，为后续的研究奠定基础。

3. 研究的方法与方案

重叠延伸pcr

第一种：用重叠延伸pcr做定点突变，采用重叠引物延伸pcr介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物，使pcr产物形成了一小段的重叠链, 然后在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

该技术主要包括以下几步：

4. 研究创新点

特色之处：

（1） 将多个基因片段由overlappcr连接起来，而不是通过酶连法进行拼接，简单且便宜。

（2） 使用的载体为枯草芽孢杆菌，与大肠杆菌相比能够自发形成感受态的菌株极少，而且感受态的维持时间较短，分子克隆效率低等不利因素限制了其在基因工程中相关的遗传操作，但枯草芽孢杆菌优良的分泌能力是它作为工程菌的一大优势^[1]。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展：

2016-3月：通过overlappcr技术将片段1，片段2，片段3 扩增出来，然后将片段1和片段2连接，片段2和片段3连接

2016-4月：通过overlappcr技术将大片段1（片段1和片段2连接得到的）和大片段2（片段2和片段3连接得到的）