马立克氏病毒致瘤基因Meq/L-Meq的载体构建及原核表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究意义、现状分析

马立克氏病（mareks disease, md）是发生在鸡体内的恶性淋巴瘤疾病，由疱疹病毒科马立克氏病病毒（mareks disease virus, mdv）侵染引起，通常在内脏器官、皮肤等处诱发肿瘤。近几十年来，mdv的毒力不断增强，致病力和致死率不断上升，mdv在导致鸡的肿瘤发生和死亡的同时，更是侵害了鸡的免疫器官，致使其处于免疫抑制的状态，继而导致免疫功能障碍，丧失抵抗感染能力或形成免疫性疾病，在临床上产生多种疾病，使鸡的生产性能下降或者死亡，对家禽养殖业造成很大的经济损失。

通过对mdv基因组的分析，已经鉴定出有46个基因编码特异性多肽，可将它们归成三大类，即（1）致瘤相关基因：132-bpr序列、meq和pp38；（2）糖蛋白基因:gb、gc、gd、ge、gh、gi、gk、gl和gp82；(3)其他基因：除上述两类之外的基因^[1,2]。在这些基因中，meq（mareks ecori q）在转化细胞中表达，编码的339个氨基酸组成的蛋白质的n-末端具有碱性亮氨酸拉链（bzip）结构域，而其c-末端有脯氨酸重复序列，通常被认为是一种转录激活因子，这样的结构域与jun/fos致瘤基因家族一致，推测其属于这一家族^[1]。大量实验数据表明，meq蛋白在所有肿瘤样品以及mdv转化t细胞中被检出，说明了在mdv引起的转化中meq蛋白起着重要的作用^[1]。上世纪90年代，kyung等^[3]发现mdvi的一个减毒疫苗株（cvi1998）中有一个180bp的片段插入到meq的orf中，称之为l-meq。这个l-meq基因的表达产物l-meq蛋白的功能还不完全清楚，通过southern blot分析得知，l-meq在一些强毒株mdvi中并没有被检测出，这表明l-meq可能与致瘤作用以及致病性的丢失有关^[4,5]。通过对meq进行原核表达，我们就能够进行多方面的研究，例如其蛋白结构的确定，以及其结合作用位点的确定，从而设计出特异性抑制meq蛋白活性的制剂来。

2. 研究的基本内容和问题

（1）研究目标

通过分子克隆技术将病毒基因克隆入细菌质粒中构成原核表达载体，并经原核表达技术与蛋白纯化技术获得具有高活性、高纯度的meq蛋白，为今后单克隆抗体的制备打下基础，为md的防治奠定基础。

（2）研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验方案：

① 带有目的基因meq/L-meq 的载体由中国农业科学院上海兽医研究所马志勇慷慨赠与。

② 将目的基因片段进行PCR扩增：根据meq/L-meq序列，设计出2条PCR引物，引物两端的酶切位点分别为EcoR I和Xba I；上游引物为：5′-ACGGAATTCATGTCTCAGGAGCCAGAGCC-3′，下游引物为：5′- ACTCTAGACTCGAGTCATCAGGGTCTCCC GTCAC-3′，由Invitrogen公司合成；反应体系：5X PCR buffer 10μl， dNTP(10mM) 2μl，上、下游引物（10mM）各1μl，基因组DNA（50ng）1μl，Taq酶0.5μl，dH₂O 34.5μl，反应条件：94℃预变性5min，循环条件：94℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 45s，共33个循环，最后72℃延伸7min，10℃保温。

③ pcDNA3-2XFlag-meq/ pcDNA3-2XFlag -L-meq载体构建：将pc3-2XFlag载体于扩增产物meq/L-meq用限制酶EcoR I和Xba I酶切，获得具有EcoR I、Xba I切口的载体和目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收获得纯化的酶切产物；分别将meq/L-meq与pc3-2XFlag进行连接，16℃连接过夜，构建重组克隆质粒pc3-2XFlag-meq/pc3-2XFlag-L-meq，连接反应体系为：5μl酶连缓冲液，1μl T₄连接酶，0.5μl pc3-2XFlag载体，3.5μl PCR产物；将重组质粒进行双酶切（EcoR I、Xba I）鉴定，后送至Invitrogen公司进行测序。根据测序情况确定是否进行下一步实验。

④ meq/L-meq基因原核表达载体的构建：分别取5μl pc3-2XFlag-meq及pc3-2XFlag-L-meq与0.5μl EcoR I、0.5μl Xhol I、3μl酶切缓冲液、21μl dH₂O混合成30μl酶切体系，放入水浴锅中37℃酶切2h，以获得具有EcoR I、Xhol I酶切端口的meq/L-meq的目的基因片段；再取5μl pGEX-4T-1载体与0.5μl EcoR I、0.5μl Xhol I、3μl酶切缓冲液、21μl dH₂O混合成30μl酶切体系，放入水浴锅中37℃酶切2h，以获得具有EcoR I、Xhol I酶切端口的5μl pGEX-4T-1载体；将酶切产物用大孔琼脂糖凝胶电泳进行分离并进行胶回收，获得纯净的目的片段及载体；分别取3μl目的基因片段meq/L-meq与1μl pGEX-4T-1载体、1μl T₄连接酶以及5μl酶连缓冲液混合，16℃连接过夜。

⑤ 转化

1). 从-70℃冰箱取出20 μl的感受态细胞，冰浴10 min；

2). 向感受态细胞中加入20 μl待转化的酶连产物，轻轻旋转几次，混匀，冰浴20 min；

3). 然后将离心管放入42 ℃水浴中热激60 s；

4). 快速将离心管冰浴2～3 min；

5). 在离心管中加入500 μl LB培养基，放入恒温振荡器（200rpm,37℃）1h；

6). 短暂离心后，吸出300μl培养基，将EP管底部菌体混匀后吸取100～200 μl菌液至含有终浓度为100 μgmL^-1氨卞青霉素的LB平板上，涂布后，于37 ℃培养12～16 h。通过对转化效果的检测，判断能否进行后续实验。

⑥ meq/L-meq基因的诱导表达：分别向50ml离心管中加入10ml LB氨苄液体培养基，挑取pGEX-4T-1-meq /pGEX-4T-1-L-meq单菌落分别接种于上述离心管中，放入恒温振荡器中37℃，250rpm过夜（~12h）；将50ml离心管中的菌液全部倒入预先准备好的装有100ml LB氨苄培养基的三角瓶中，放入恒温振荡器中37℃，250rpm，后每小时测一次OD₆₀₀值,直到OD₆₀₀值达到0.5~0.6；之后，向每个三角瓶中分别加入55μl的IPTG,使其IPTG终浓度达到0.5mM，将三角瓶放入恒温振荡器中37℃，250rpm，3h， 即使目的基因得到诱导表达。

⑦ 表达产物MEQ/L-MEQ的纯化及鉴定：采用GST纯化系统对MEQ/L-MEQ蛋白进行纯化，后经SDS-PAGE凝胶电泳对纯化效果进行检测。

技术路线：

可行性分析：

分子克隆技术、原核表达技术以及蛋白纯化技术在现如今科技的飞速发展中已经相当成熟，结合必要的理论知识，一定能对meq/L-meq基因进行载体构建和原核表达。

我本人对于这个课题都有极大的兴趣，兴趣是最好的老师，它可以激励我们朝着既定的目标努力。基于我从大二上学期开始，就在资环院植物营养系微生物课题组实验室进行了一定的科研锻炼，已经能较为熟练地掌握基本的分子克隆实验技能。并且在Yong Sam Jung老师的指导下制定了较为详细的研究方案，使我们的研究能有条不紊地开展。

另外，我校动物医学院在预防医学方面的研究具有很强的实力，具备良好的理论和技术基础，能为我的研究提供强有力的支持，这也保证了后期实验室研究的可行性。

4. 研究创新点

目前，用来防治md的方法主要有以下3种：疫苗接种、遗传抗性和生物安全。

可见疫苗在现在以及将来，仍是预防和控制md的重要手段。

为了找到有效预防md的抗体，我们希望获取高精度、高纯度、有活性的目的蛋白，并将其作为抗原诱导产生具有高特异性的抗体，对md的预防与治疗做出指导。

5. 研究计划与进展

项目研究计划及预期进展

2014年10月2014年11月 在实验室学习并掌握分子克隆技术、原核表达技术以及蛋白纯化技术等实验技术和工作流程，并深入学习相关理论知识，为接下来的研究工作打好基础。

2014年11月2014年12月 完成目的片段扩增、重组质粒构建、原核表达载体构建等实验步骤，并进行相应的鉴定实验。