转基因甘蓝型油菜c染色体基因向其与野芥菜回交后代（BC1F5，BC2F4，BC3F3）的渗入开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1国内外研究概况

十字花科（brassicaceae）是植物界中公认的世界性大科，在全世界大约有包括330个属和3500个物种，主要分布在北温带地区和马德雷趣（北美西部）。中国大约有112个属435个种，广泛分布于全国，以西南、西北、东北高山区及丘陵地带为多，平原及沿海地区较少（王建林,2006）。

芸薹属（brassica）是十字花科植物中最为重要的一个属，包含许多蔬菜、油料及饲料作物等经济上有重要价值的作物。韩国学者禹长春在1936年总结，并提出禹氏三角（u'striangle），他认为芸薹（b.campestris，2n=20，aa）、黑芥（b.nigra，2n=16，bb）和甘蓝（b.oleracea，2n=18，cc）为芸薹属的基本种，在自然条件下，基本种之间通过杂交，得到芥菜（b.juncea，2n=36，aabb）、甘蓝型油菜（b.napus，2n=38，aacc）和埃塞俄比亚芥（b.carinata，2n=34，bbcc）3个异源四倍体物种。其中a、b、c分别代表白菜、黑芥和甘蓝的基因组，ab、ac和bc表示芥菜、甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥的基因组（u，1935）。其后，禹氏三角被很多科学家所证明，并提出二倍体物种本身可能就来源于多倍体的结论。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标

研究抗草甘膦和抗草丁膦转基因油菜（brassicanapus）的c-基因组特异片段向野芥菜的渗入是否存在差异，为转基因油菜的安全性评估提供更深入的实验依据。

2.2研究内容

3. 研究的方法与方案

3.1技术路线

3.2实验方案

3.2.1研究材料

3.2.2DNA提取材料准备

本实验材料均在南京农业大学牌楼实验基地播种，待幼苗长出后采集新鲜幼嫩的植物叶片备用。

3.2.3DNA提取

DNA提取方法为SDS大量提取法(郑康乐等,1990)，并经过一定的修改。DNA提取步骤如下：

1) 称取5g新鲜杂交后代，在液氮中迅速研磨至粉末状，研磨过程中不断加入液氮，勿使其干；

2) 将粉末移至50ml液氮冷冻的聚乙烯离心管中，-20℃保存；

3)所有样品研磨完成后，加抽提缓冲液。缓冲液65℃预热后，取20ml加入50ml离心管中，拧紧管盖后，迅速将溶液与叶片粉末混匀，60-64℃水浴30分钟；每隔5-10分钟充分但轻柔颠倒混匀一次；

4) 将离心管移至震荡摇床上，室温下震荡混匀20分钟，震荡频率30次/分；

5) 向离心管中加入20ml氯仿混合液（含20%乙醇和4%异戊醇），再移至震荡摇床上震荡混匀20分钟，震荡频率30次/分；

6) 将离心管配平，离心15分钟，转速3000rm/分；

7) 离心后，将上清液小心移至新的50ml离心管，注意不破坏下层杂质；

8)向上清液中加入等体积的4℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温放置20分钟，至出现絮状沉淀；

9) 转移沉淀转至含有3mlTE（Tris-HCl10mmol/L，EDTA1mmol/L）的10ml离心管中，充分溶解；

10) 6000rm/分离心10分钟，沉淀杂质，将上清液转移至新的10ml离心管中；

11) 向离心管加入5μlRNAase（10mg/ml），37℃水浴温浴10分钟；

12)先加入1/10体积的醋酸钠（3mol/L，PH5.2），混匀，再加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，混匀，-20℃冷冻20分钟，至出现絮状沉淀；

13) 将沉淀转移至1.5ml离心管中，加70%乙醇洗涤两次；

14) 10000rm/分离心2分钟，沥干乙醇，室温下通风橱中风干；

15) 加入500mlTE，用手轻弹使沉淀溶解；

16) 取5μl溶液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测DNA提取的质量。

3.2.4引物筛选

由于前人已完成对引物的选择，在他们研究的基础上，直接沿用了他们对引物的选择，见下图

表1具有多态性的17对共显性引物

Table117pairsofcodominantprimersusedforDNAamplificationinthisstudy

方法：各样本取10μl按顺序加入96孔板上，并加上10-20μl液体石蜡封住液面。PCR反应由两台热循环仪完成BioRAD（PTC-200）和TAKARA（TaKaRaPCRThermalcycler）。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸lmin，30个循环；最终再进行72℃延伸8min，降温至4℃，结束反应，取出96孔板，暂存于4℃冰箱。

3.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：同PCR产物的长度与其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳的速率成反比，产物长度越短其移动的速度越快，长度越长其移动的速度越慢，以此达到分离条带的目的。通过合适条件的垂直电泳可以检测出不同产物间条带长度的差异。

根据SSR数据库中的信息可以判断用于分析的各SSR引物的PCR产物其长度大多在100～300bp之间，6%聚丙烯酰胺凝胶的分辨率可以达到要求，并且采用DNAMakerⅠ作为对照指示产物条带长度。

3.2.6聚丙烯酰胺凝胶的配制

1）40%聚丙烯酰胺母液配制：100ml去离子水中溶入38g丙烯酰胺和2克甲叉双丙烯酰胺（19：1）定容，保存于4℃冰箱中备用；

2）制胶板清洗：小心的用洗洁精清洗制胶用长短玻璃板，至无水珠流下，然后用去离子水漂洗，自然晾干；

3）封闭：选择玻璃较光滑的一面靠内侧，在长短板之间夹上两片1mm厚的间隔片，用大夹子整齐固定。将融化并已经适当冷却的琼脂糖溶液倒入制胶槽中，溶液高度适中，然后将已经固定的长短制胶板两端同时插入琼脂糖溶液中，虹吸作用会使部分琼脂糖进入两板之间。将制胶板固定制胶架上，琼脂糖室温冷却之后会将两板下端封闭；

4）催化剂配制：根据制胶数量确定配制的聚丙烯酰胺溶液所需体积。在适量的去离子水中加入终浓度为1倍的TBE缓冲液母液和终浓度为6%的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（19：1）母液，充分混匀；再按10-15μl/ml加入过硫酸铵（10%，(NH4)2S2O8，Ammoniumpersulfate）和按1-2μl/ml加入TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），两种催化剂的用量根据室温进行具体调整，温度低时适当增加用量，可以加速胶的凝固。迅速搅拌后进行灌胶；

5）灌胶：将加入催化剂的聚丙烯酰胺混合液沿短板的一端慢慢灌入两板之间的缝隙，直至上端开口处，然后将52孔胶孔梳插入两板之间，再加入少许混合液将缝隙完全灌满，注意赶走气泡；

6）加缓冲液：取下胶孔梳，并剥离封口用制胶槽和琼脂糖，将之安装在电泳槽上，加入电泳缓冲液，并保证没有气泡。

3.2.7电泳

每个加样孔中按顺序加入5μlPCR产物，在合适的位置加入1μl标准DNA片段长度标记（DNAMarkerⅠ,天根生化）。电泳仪的型号为南京大学DYY-8B稳流稳压电泳仪，电泳槽型号为DYG-28D。电泳电压为120V，电泳时间为2-3小时。

3.2.8银染与显色

电泳后，通过改进的银染对其进行显色：

1) 取下胶板，然后轻轻撬开制胶板的长短板，用去离子水将凝胶洗脱下来。清洗两遍。沥干；

2)将胶板放入盛有400ml0.1%AgNO3溶液的染盆中，在摇床上漂染15min，转速60rm/min。完成后沥干，加入去离子水洗涤两次；

3)将胶板放入盛有400mlNaOH溶液（1.5g/100mlNaOH，0.019g/100ml四硼酸钠，0.4ml/100ml甲醛）显色15min，摇床上振荡10分钟，转速60rm/min。

4)显色完全后，将NaOH沥干，再用自来水充分洗净，用玻璃板捞出，平展整齐，在室温下风干至无水流出，然后将胶放于灯箱上，用数码相机(CanonPowerShotG12)拍照记录。

3.2.9数据分析

统计后代群体中含有C染色体特异性标记的个体，计算每条引物平均被检测到的次数，每个植株平均检测到的引物数量，并在不同的群体中进行比较。

4. 研究创新点

延续实验计划，结合前人研究数据，获得更全面完整的结果，从更长期的时间角度研究转基因甘蓝型油菜对其与野芥菜回交后代C染色体基因的渗入，从而获得更完善的评价，探究其后代中抗性基因遗传频率，为转基因油菜的引入种植安全性问题提供一定的理论依据。

5. 研究计划与进展

2014.09-2014.12采集回交1代子4代，2代子3代，3代子2代叶片，提取dna，进 行ssr

2015.02-2015.03文献查阅

2015.03-2015.04完成数据整理