崇明拟异小杆线虫不同单菌组合的miRNAs差异表达研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

昆虫病原线虫与其细菌共生物互惠共生，其中嗜线虫致病杆菌属(xenorhabdus) 与斯氏线虫(steinernema)共生、发光杆菌属(photorhabdus)与异小杆线虫(heterorhabditis)共生、嗜线虫沙雷氏菌（serratia nematodphila）和拟异小杆线虫（heterorhabditidoides chongmingensis）共生^[1-4]。相比于传统农药，昆虫病原线虫-共生菌复合体可以作为一种新型绿色农药来开发，其具有宿主范围广，对人畜无害，不污染环境，杀虫速度快且能以低成本大规模生产等优点，现已成为目前生物防治领域的热点。目前研究发现，昆虫病原线虫-共生菌复合体对大量隐蔽害虫和土壤害虫的防治方面取得显著成绩^[5,6,7,8-10]，引起了产业界和科研部门的高度重视^[7,23,24]。昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内，二者互惠共生。在这类生物防止因子中，线虫作为共生菌的传播媒介，对宿主昆虫起致病作用的是共生菌的代谢产物。这些代谢产物可以广泛应用于医药和农业，如抗细菌^[11-19]、杀虫^[14]、杀真菌^[15]、杀线虫^[19]、抑制肿瘤细胞生长^[19-22]和抗病毒等。所以对昆虫病原线虫与共生菌之间的共生机制的研究，对于生物防治具有重要意义。它们之间的共生作用和致病作用分别由各自一系列的基因来调控。

mirna是一类内源性非编码调控小分子rna，它们广泛存在于真核生物中，在进化过程中高度保守，目前已被证实参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、细胞分化、激素分泌等生理过程^[23]。由于mirna存在的普遍性和调控功能的多样性，对其的鉴定挖掘及对其功能的探索已成为生命科学研究的热点和前沿。

dz0503sbs1^t、dr186菌株均为本实验室发现的沙雷氏菌属昆虫病原线虫共生菌。拟异小杆昆虫病原线虫dz0503cmft的无菌卵在无菌培养基上离体培养为无菌侵染期幼虫，再各接入共生菌dz0503sbs1^t和dr186培养。经实验发现两种共生菌菌株对线虫的恢复发育、后代产量、雌雄比及形态大小的影响。实验室前期通过二维凝胶电泳检测到，同一种拟异小杆昆虫病原线虫rg081015与不同的沙雷氏菌dz0503sbs1^t和dr186共生情况下，存在一些差异表达的蛋白点^[24]。这些新发现，可以做为深入探索拟异小杆属线虫dz0503cmft与共生菌共生关系专一性以及两者如何发挥杀虫作用的分子机制的研究基础。发现及确定mirna的调控机制及其靶基因是进一步需要解决的问题。

2. 研究的基本内容和问题

本研究主要通过拟异小杆昆虫病原线虫DZ0503CMFT接入共生菌DZ0503SBS1和DR186中培养，构成线虫共生菌组合DZ-S1和DZ-186。实验发现，这两种共生菌对崇明拟异小杆线虫的繁殖，雌雄比，发育有影响。实验室前期已经对DZ-S1和DZ-186在不同时期一些已知miRNA进行了高通量测序，本研究通过荧光定量来进一步验证比较DZ-S1和DZ-186在不同时期已知miRNA miR-1,miR-81,miR-54这三个miRNA表达量的差异，探讨这三个miRNA对线虫与共生菌共生的影响。并且构建了这三个miRNA的过表达载体，用于后续与靶基因互作的功能验证。

3. 研究的方法与方案

1.线虫学实验

1.1线虫的繁殖与保存

所有进行研究的线虫均用大蜡螟进行繁殖。在铺有2张湿滤纸的培养皿 (6015 mm) 里将15条大蜡螟暴露在大约2000条侵染期线虫的周围并放于20 3 ℃培养箱中保湿培养。雌雄同体线虫和第1代成体线虫各自通过解剖被侵染的大蜡螟收集。侵染期线虫在接种数天后从大蜡螟尸体中出现。部分线虫用热水杀死后，用TAF或乳酸酚进行固定后用甘油进行封固，制备成标本保存。线虫活体在实验室内采用大蜡螟和海绵两种方法保存线虫。

1.2无菌线虫的获得和培养

侵染期线虫感染大蜡螟数天后，从尸体内分离得到怀卵的大雌母线虫，用0.4M NaOH与2.5%NaOCl充分摇动或旋转5分钟，确保杀死大雌母线虫，释放并消毒体内卵。将所得卵3000rpm离心，弃上清，再用无菌蒸馏水洗卵3-5次，将卵悬液滴入肝-琼脂培养基上，25℃恒温培养。

1.3无菌线虫的验证

通过离心得到清洗干净的IJs表面用15%双氧水消毒60min，再用15ml的无菌林格氏液（配方100mM NaCl,1.8mM KCl, 2mMCaCl2, 1mM MgCl2, 5mM HEPES pH6.9）清洗三次并离心，将得到的线虫碾碎涂布于NBTA鉴别培养基上。

1.4 无菌侵染期幼虫的获得

无菌培养的线虫，通过离心、清洗得到干净的IJs表面用15%双氧水消毒60min，再用15ml的无菌林格氏液（配方100mM NaCl,1.8 mM KCl, 2 mMCaCl2, 1mM MgCl2, 5mM HEPES pH6.9）清洗三次并离心，得到的线虫保存于7ml的林格氏液中。

1.5单菌线虫的培养

侵染期线虫感染大蜡螟数天后，从尸体内分离得到怀卵的大雌母线虫，用0.4M NaOH与2.5%NaOCl充分摇动或旋转5分钟，确保杀死大雌母线虫，释放并消毒体内卵。将所得卵3000rpm离心1分钟，弃上清，再用无菌蒸馏水洗卵3-5次，将卵悬液滴入已经在肝-琼脂培养基上培养2d的共生菌落上，25℃恒温培养。

1.6单菌培养线虫侵染期幼虫带菌率的测定

将共生单菌培养的线虫通过体表用15%双氧水消毒60分钟，再用无菌林格氏液清洗三遍，用线虫挑针在无菌超净台中挑取单条线虫于LB培养基中，37℃培养过夜观察。测定线虫的带菌率。

1.7沙雷氏菌属共生菌对拟异小杆线虫繁殖率的影响

挑取纯化的沙雷氏菌DZ0503SBS1T，DR186在肝-琼脂培养基上划线，制备线虫生长培养基，在25℃恒温培养箱中培养48h后，分别接种经无菌处理的拟异小杆线虫DZ0503CMF^T卵悬液，保证每皿接种量为10010颗卵，25℃条件下培养，设不同共生菌与线虫组合，每个处理9皿，接种卵后3d-5d孵化后，再继续培养3d，每处理取3皿收集单菌线虫，在显微镜下检测是否发育为成虫及发育率；4d后每处理再取3皿收集单菌线虫，调查线虫在不同共生细菌中的雌雄比；卵孵化后15d后，每处理取3皿，调查不同处理中产生的侵染期幼虫的数量。另外，在每一个拟异小杆线虫与共生菌组合产生的侵染期幼虫中随机挑取40条，在60-65℃温水中杀死线虫，制备临时玻片，在显微镜下测量其体长与最大体宽。

2. 荧光定量测定崇明拟异小杆线虫与其共生菌组合DZ-S1和 DZ-186中已知miRNA miR-1，miR-81，miR-54表达量的变化

2.1实验室前期已经对无菌线虫、DZ0503SBS1^T与DR186三种共生菌线虫的 miRNA 的基因芯片进行了高通量测序分析，并且利用ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo，日本）将三种线虫含有小RNA的总RNA进行反转录，cDNA置于-20℃备用。

2.2 miRNA 实时荧光定量 PCR 检测

利用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo，日本）对线虫cDNA进行实时荧光定量PCR检测，每个cDNA样品设置3个重复。用ABI 7300 HT实时荧光定量PCR仪检测两种线虫中miRNA的表达量。

2.3 miRNA 相对表达量的计算参照 Livak 等（2001）发明的基因表达量相对定量分析方法^[21]，实验组相对于对照组 miRNA 的表达量变化用下列公式表示：2^－△△Ct=2^{(Ct 对照组 miRNA-Ct 对照组 U6-Ct 实验组 miRNA Ct 实验组 U6)}

Ct 值由计算机根据扩增曲线自动分析得出，U6 snoRNA 为内参。利用茎环引物实时荧光定量RT-PCR来验证芯片结果的可靠性，U6 snoRNA 作为内参，每个样本设置 3 个重复。miRNA 的扩增曲线呈S型且熔解曲线均在 85℃左右呈单一峰值，说明为特异性扩增，扩增效果良好。

3.崇明拟异小杆线虫与其共生菌组合DZ-S1和 DZ-186中已知miRNA miR-1，miR-81，miR-54过表达载体的构建

3.1 Trizol法提取两种线虫总RNA

3.1.1液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

3.1.2细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。12,000rpm 离心 5min，弃沉淀。

3.1.3按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，剧烈振荡15s混匀后室温放置 15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组 DNA 断裂。4℃ 12,000g 离心 15min。

3.1.4吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取 DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于 4℃冰箱,若只提 RNA，则弃下层酚相。

3.1.5按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol（与当前水相等体积）加入异丙醇混匀，室温放置 5-10min。4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。

3.1.6按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇（DEPC水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀(洗涤时，一定弹起沉淀，上下缓缓颠倒6X，后离心5~10min，再重复此步骤后晾干)。4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。

3.1.7室温晾干或真空干燥 5-10min。 注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。

3.1.8进行DNase 处理或者用50ul H2O，TE buffer或 0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min（注：H2O、TE或 0.5%SDS均须用DEPC处理并高灭菌）。

3.1.9 -80℃保存。

3.2总RNA琼脂糖凝胶电泳及质量检测

3.2.1 用洗洁精将制胶模具、梳子、电泳槽清洗，用蒸馏水冲洗干净后，将模具、梳子等放入电泳槽加 30%双氧水，浸泡 30min；

3.2.2 倒掉双氧水，用 DEPC水冲洗电泳槽，用无水乙醇擦拭电泳仪器，晾干；

3.2.3组装好制胶模具，封闭模具边缘，架好梳子，用 0.5TBE buffer 制作 1%琼脂糖凝胶，凝胶冷却后拔出梳子，将凝胶置于加有 0.5TBEbuffer 的电泳槽中，缓冲液以浸没胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

3.2.4 在超净工作台上，用移液器吸取 RNA 样品 5.0μL与1μL 6Loading Buffer混匀后小心加入电泳槽中被浸没的凝胶加样孔内；

3.2.5 打开电源开关，调节电压至 120V，约15min后终止电泳 ( 根据样品Loading Buffer中指示剂的位置判断是否终止电泳)，将凝胶用EB染色放于凝胶成像仪上初步检测总 RNA的质量。

3.3 cDNA 合成

3.3.1将RNA模板和RNase-Free Water 溶解，5SuperQuick RT Master Mix，并置于冰上备用。

3.3.2根据以下表格配制反应体系，总体积为10μL（反应液配制请在冰上进行）。

3.3.3涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

3.3.4 37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

3.3.5逆转录产物可直接用于荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

3.4 microRNA与其靶基因的合成

3.4.1查询miRBase数据库和其对应的转录组数据，获得microRNA的前体序列和靶基因的序列。

3.4.2应用primer5.0进行引物设计，在其两端加入酶切位点及其保护碱基。用以构建microRNA和其靶基因的过表达载体分别为L4440和pPD95.77， microRNA的酶切位点为NheI和HindIII，靶基因的酶切位点为HindIII和BamHI。设计好的引物送生物公司合成。

3.4.3 用合成好的引物，以cDNA为模板进行PCR，扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并送生物公司测序验证。

3.5 克隆载体的构建

20μL连接体系包括10μL2SolutionI、1μL的pMD19-T载体和9μL纯化的目的片段，在4℃连接过夜，构建重组质粒。

3.6目的基因和L4440质粒的双酶切

3.6.1 L4440质粒双酶切反应体系

3.6.2 目的基因双酶切反应体系

*反应条件：37 C水浴2h

3.6.3 反应完成后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将双酶切产物切胶回收纯化。

(1) 在长波紫外灯下,切取含目的条带的琼脂糖凝胶。

(2)将切下的凝胶放入1.5mL EP管(切胶前称取、记录该管空重)中,称量EP管质量,计算出凝胶质量,按100 mg=100μL 的比例将凝胶质量换算为体积。

(3)加入3倍凝胶体积的溶胶/结合液DB,56C水浴放置10 min,每2-3min旋祸振荡一次，帮助溶解。

(4)每100mg最初的凝胶质量加入150μL异丙醇,旋祸振荡混匀。

(5)吸取上述混合液,转移至吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)中,12000 rpm离心1 min,弃滤液。

(6)加700nL漂洗液WB,12000 rpm离心30s,弃滤液。

(7)加500fiL漂洗液WB,12 000 rpm离心30s,弃滤液。

(8)将吸附柱AC放回空收集管中,12000 rpm离心2 min。

(9)将吸附柱AC置于洁净的1.5 mL EP管中,在吸附膜正中央加50μL高压灭菌水。室温静置2 min, 12000 rpm离心1 min洗脱DNA。回收产物于 -20C保存备用。

3.7目的基因和L4440的双酶切纯化产物的连接

连接反应体系：

*16 C连接过夜，反应产物 -20 C保存备用。

3.8连接产物的转化

3.8.1 感受态细胞的制备

(1)将甘油保存的受体菌DH5α在LB平板上划线,37 C过夜活化培养；

(2)挑取一个单菌落接种到20ml LB液体培养基中，37 C震荡培养过夜；

(3)按1%的接种量，吸取0.5ml过夜培养的菌液接种至50 ml LB液体培养基中，37 C 震荡培养 2-3 h (OD600 约为 0.4-0.6)；

(4)在无菌条件下将菌液转移到50ml灭菌离心管中，冰置10min冷却；

(以下步骤保持在冰浴中完成)

(5) 4C，10000 r/min离心10min收集菌体细胞，倒出培养基,同时将离心管倒置1min使残留培养基流净；

(6)用5 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2悬浮菌体沉淀，冰置10min；

(7) 4C，10000r/min离心10min收集菌体细胞，倒出CaCl2；

(8)用1ml预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，按200μL /支分装于1.5 ml无菌离心管中，直接用于转化或-70 C储存备用。

3.8.2连接产物转化

(1)在200μL的感受态细胞中加入10μL 连接反应物，轻轻吸打混匀,冰置30min；

(2)将上述反应物于42C热激90s,迅速取出至冰浴中放置1-2 min；

(3) 加入800μL灭菌的LB培养液，37 ℃、250 r/min振荡培养1h；

(4) 取200μL培养后的菌液涂布于氨苄青霉素平板上，37 ℃倒置培养过夜；

3.9重组貭粒的鉴定

3.9.1重组质粒的提取

挑取阳性菌落接种于10mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃、225 rpm振荡培养10-12h，用质粒小量抽提试剂盒提取质粒。

(1)取1.5 mL菌液，12 000 g，4 ℃离心1 min,弃去培养基。

(2)重复步骤(1)两次。

(3)用250μL含RNaseA的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。

(4)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，时间不超过5分钟。

(5)加入 350μL Buffer S3，立即上下颠倒 10 次，12 000 g，4 ℃离心 10 min。

(6)上清转移到DNA制备管，12 000 g，4 ℃离心1 min。

(7)将制备管放回离心管中，加500μL Buffer Wl，12000g，4 ℃离心1 min，弃滤液。

(8)将制备管放回离心管中，加700μL Buffer W2，12000g，4 ℃离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液。

(9)将制备管放回离心管中，12000 g，4 ℃离心1 min。

(10)将制备管置于另一干净1.5 mL离心管中，在DNA制备膜正中央加入60μL，60 ℃预热的灭菌水，室温放置2min，12000 g，4 ℃离心1 min。

(11)取1μL质粒 DNA 溶液和99μL ddH20于酶标仪上测算质粒DNA的浓度和纯度。

3.9.2 PCR鉴定阳性重组质粒

以提取的重组DNA为模板，使用自行设计的引物进行PCR反应。

PCR反应体系为：

*PCR反应完成后，取5μL反应产物，以1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。对PCR鉴定筛选出的阳性克隆做进一步的双酶切鉴定。

3.9.3 双酶切鉴定阳性重组质粒

酶切反应体系为：

*反应条件： 37 ℃水浴3h；双酶切反应完成后，取5μL反应产物，以1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

3.9.4 DNA测序

将阳性重组质粒送生物公司进行测序，测序结果与目的基因序列进行比对。

可行性分析

1.本课题所在实验室为南京农业大学生命科学学院动物学实验室，该实验室长期从事线虫和miRNA方面的研究工作，有着丰富经验，相关的研究设备及试剂也齐全。

2.本课题参与人员成绩优良，主持过SRT项目，已经提前阅读了大量相关文献，对本项研究的背景知识有一定了解，并且有充足的时间保证项目的顺利进行。

4. 研究创新点

通过对崇明拟异小杆昆虫病原线虫DZ0503CMFT接入共生菌DZ0503SBS1和DR186中培养，构成线虫共生菌组合DZ-S1和DZ-186。通过荧光定量来测定线虫共生菌组合DZ-S1和DZ-186在不同时期时已知miRNA：miR-1，miR-81，miR-54这三个miRNA的表达量，探讨这三个miRNA对线虫与共生菌共生的影响。然后构建了这三个miRNA的过表达载体，用于后续与靶基因互作的功能验证。

5. 研究计划与进展

2014.10-2014.11 昆虫病原线虫及共生菌的不同组合混合培养；

2014.12-2015.1 荧光定量测定不同时期dz-s1和dz-186的mirna表达量的变化；

2015.1-2015.2 过表达载体的构建；