1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
结核病（tuberculosis，tb）是由结核分枝杆菌引起一种传染病，主要是人型和牛型。人型结核杆菌感染的发病率最高。临床上所指的结核病多由上述两型引起。结核病主要经呼吸道传染，也可经消化道感染，少数经皮肤伤口感染。呼吸道传播是最常见和最重要的途径。肺结核病人(主要是空洞型肺结核)从呼吸道排出大量带菌微滴。吸入这些带菌微滴即可造成感染。直径小于5μm的微滴能到达肺泡，因此其致病性最强。到达肺泡的结核杆菌趋化和吸引巨噬细胞，并为巨噬细胞所吞噬。在有效细胞免疫建立以前，巨噬细胞将其杀灭的能力很有限，结核杆菌在细胞内繁殖，一方面可引起局部炎症，另一方面可发生全身性血源性播散，成为以后肺外结核病发生的根源。结核病是世界传染性疾病之首，已经造成了大量的经济损失，是发展中国家的主要公共健康安全隐患。
世界卫生组织2012年全球结核病控制报告指出，全球每年新增870万结核病患者（13％是结核合并hiv 感染患者），并且每年约有140万肺结核病患者死亡。根据世界卫生组织（who）的统计, 我国结核病患病人数居世界第2位，仅次于印度；我国不仅是全世界27个严重流行耐多药结核病的国家之一，同时也是全世界22个结核病流行严重的国家之一。而2013年的全球结核病控制报告中，虽然全球的结核病死亡数也降至130万，但几乎有五十万人在2012年罹患耐多药结核病，而其中得到诊断者不足四分之一，原因主要是难以获取高质量的诊断服务。结核病的细菌学诊断阳性率低，培养则耗时长，至今尚缺乏快速、简便、灵敏度高、特异性强的检测方法，这给早期诊断带来困难，尤其肺外结核、儿童结核不易获取标本。即使在较具规模的综合性医院，该病的误诊率或漏诊率亦有20％～30％，致使该病病情延误。因而研发一种简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断tb新方法是防治结核病继续扩张和蔓延的关键。
自1998年结核分枝杆菌基因组破译成功后, 研究者将结核分枝杆菌和卡介苗(bcg)的基因组序列进行比较,发现bcg有16个缺失的基因区域(rd) ,包括rd1-16,其中的rd1 区只存在于致病性分支杆菌中，不存在于bcg 和其它非致病性分枝杆菌，从而导致毒力和免疫原性产生相应的改变。而rd1区有多种与m.tb 免疫原性相关的重要抗原，比如：培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10，cfp10），6kd早期分泌抗原靶（early secreted antigenic target-6 kd antigen，esat6）等。esat6由mtb rd1位点上的esat6基因( 288 bp) 编码,含95个氨基酸, 分子质量单位为9.904ku。esat6仅在致病性分枝杆菌( 如人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、微黄分枝杆菌) 中表达, 特异性强。所有bcg 亚株和非致病分枝杆菌均不表达。esat6 有多个t细胞、b细胞表位,是抗结核免疫反应的主要配体, 有较强的免疫原性和免疫反应性。因此esat6有望成为检测mtb抗体的特异性抗原,其优势是能区分mtb自然感染和bcg接种以及非致病性分枝杆菌感染后产生的抗体。sensen等发现esat6不仅存在于培养物滤液中。还存在于mtb 细胞浆和细胞壁中, 但不存在于细胞膜上,而且esat6没有信号肽序列, 表明它可能是通过一种非信号肽依赖形式分泌到细胞外。这种分泌方式效率较低, 而激活b细胞需较大量的抗原, 这可能是结核病人或小鼠中抗esat6抗体水平不高的原因之一。所以, 单纯利用esat6的免疫原性可能不太理想。因此，近年来又发现另一种低分子量m.tb培养滤液蛋白cfp10, cfp10由于与麻风分枝杆菌l45有40 的同源性, 因此又名l45抗原同源性蛋白(lhp) , 能够引发ppd 阳性试验者的外周血单核细胞的增殖反应和ifn-c的产生。与esat6相同的是, cfp10也是免疫优势抗原, 能诱导机体产生免疫应答,它与esat6有着相同的操纵子和启动子，并且在位置上相互邻近，甚至可以同时出现在m.tb 培养滤液中，编码cfp-10的基因rv3874的3c端位于esat-6基因rv3875上游34bp处,2个基因方向一致,因此，2种蛋白不但可以协同表达，而且在功能上可能会相互作用。
而单独表达的esat6蛋白则不能发挥其完整的免疫保护活性。已有研究表明,cfp10对于esat6蛋白形成完整的空间构像非常重要。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：构建结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，m.tb）cfp10-esat6融合基因原核表达质粒，并且在大肠杆菌中表达融合蛋白，最终得到纯化的融合蛋白。
内容：用实验室已构建好的pet-32a( )-cfp10和pet-32a( )-esat6的重组质粒作为模板，pcr法分别扩增出cfp10和esat6。然后，利用基因拼接法中的genesoeing基因拼接方法扩增得到cfp10 -esat6融合基因。将融合基因克隆至pet-28a( )载体，得到pet-28a( )-cfp10-esat6重组质粒后，转入e.coli bl21（de3） plyss，通过异丙基硫代半乳糖苷（iptg）诱导剂诱导表达目的融合蛋白，再用亲和层析的方法纯化带有一个his-tag的融合蛋白。
拟解决问题：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1、质粒和菌株：中山大学医学院免疫学教研室中提供的m.tb h37rv株系、实验室已构建好的pet-32a( )-cfp10和pet-32a( )-esat6的重组质粒、pet28a载体、dh5α感受态细胞（卡那抗性）、bl21(de3) plyss感受态细胞。
2、研究方案：
4. 研究创新点
近年来, 结核病的卷土重来使得世界各国的医务工作者不得不再次重视这一严重威胁人类健康的疾病。目前，用于诊断结核病的常规方法是胸部x片、组织培养、抗酸染色和血清学诊断、结核菌素皮肤试验（tuberculin skintest，tst），但这些方法均存在不足。胸部x 片的结果只能作为辅助诊断，无法作为直接的诊断标准；而组织培养耗时过长；抗酸染色的灵敏度不高；血清学诊断利用不同抗原来检测mtb 虽然快速，但缺乏敏感性。核酸扩增技术是一种新方法，虽然特异性较强，但假阳性结果也较多。tst方法中作为结核病皮试和免疫学诊断试剂的结核菌素纯蛋白衍生物( ppd) 是多种抗原的混合物, 所含的抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及bcg 所共有, 由于交叉反应的存在, ppd 皮肤试验的诊断价值有限。因此寻找准确、快速的诊断方法，对结核病的防控十分重要。
hanif 等研究发现，结核分枝杆菌rd1区是区别致病性结合分支杆菌和非致病性结核分枝杆菌的关键所在，rd1区只存在于结核分枝杆菌群( 包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝杆菌) 及少数几种分枝杆菌, 如堪萨斯分枝杆菌、苏加分枝杆菌、海鱼分枝杆菌中, 而bcg各菌株均没有。rd1区编码的4 种蛋白pe35、ppe68、cfp-10、esat-6 可使感染结核分枝杆菌的机体产生特异性的强迟发性超敏反应。esat-6 和cfp-10 均是小分子量的分泌蛋白,具有很强的细胞免疫活性, 在感染早期, t细胞识别这两个抗原,介导机体产生保护性细胞免疫应答。重组cfp-10蛋白和esat6重组蛋白具有和天然蛋白相同的抗原性, 可致结核菌再感染小鼠的记忆效应t 细胞增殖和ifn-c早期大量产生。但单一esat-6抗原或cfp-10抗原作为血清诊断抗原的敏感性差, 联合应用时, 在不降低特异性的情况下, 能明显提高敏感度。因此, 本研究将在同一启动子控制下的cfp-10和esat6基因融合表达, 一方面是希望在cfp10参与下保证esat6天然构像, 以最大程度发挥其免疫活性, 另一方面是希望发挥cfp10蛋白免疫优势。另外, 由于融合表达的蛋白具有较大的分子量, 有利于提高免疫原性。
自1995 年, andersen在结核分枝杆菌短期培养滤液中发现esat6抗原以来, 国内外许多研究者针对esat6、cfp-10两个基因分别进行了克隆表达，国内张灵霞、蒋玉凤等还分别在构建了这两个基因的真核和原核表达载体。随后陈全应用pqe30 表达载体构建了esat6-cfp10 融合蛋白的大肠杆菌表达株。但本研究所使用的pet-28a表达载体与陈全所用到的pqe30表达载体有较大的差别。本研究用到的pet-28a载体的启动子是t7，它比pqe30 的t5启动子的启动转录能力更强，能更大增加增加蛋白表达量。本研究还应用了genesoeing基因拼接法，在两个目的蛋白之间插入了(g4s1)315个疏水性氨基酸的接头,这个接头具有非常良好的柔顺性和折叠性，能在最大程度上减少两个蛋白在高级结构形成时的相互影响，从而保护了两个蛋白各自的天然构象。另外，pet-28a作为载体更大的一个优势在于其本身携带了6个组氨酸，在重组蛋白纯化时发挥了重要作用，它增加重组蛋白的可溶性表达，无需像包涵体表达那样要变性和复性处理，从而简化了纯化步骤，它还能与金属螯合亲和层析柱上固定的某些金属离子如镍，优化了纯化效果，在最大程度上保护了纯化后的重组蛋白的免疫学活性，获得的融合蛋白的纯度能达到90％以上。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2013.12.25-2014.1.20 参阅相关的文献和资料，设计相关融合基因的引物，寻找对应的cdna。
2014.2.26-2014.3.26 完成cfp10-esat-6 融合基因原核表达质粒的构建及其鉴定工作，并进行融合基因测序。
