1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
灵菌红素（piodigiosin，pg）是一种重要的天然红色素，其分子结构特征是含有一个三吡咯环的大共轭体系骨架[1]，它具有抑制细菌、真菌、疟疾、藻类和肿瘤细胞等多种生物学活性[2]，因此在许多行业具有较大的应用前景（如医药、化工、染料等）[3]。灵菌红素家族中还包括一些其他形式的灵菌红素，如十一烷基灵菌红素、环壬基灵菌红素、环灵菌红素、丁基-间-环庚基灵菌红素等[4]。作为灵菌红素家族中的一员，pg主要是一些沙雷氏菌属（serratia）、放线菌属、假单胞菌属、海洋类细菌等的次生代谢产物，其中粘质沙雷氏菌是pg的主要生产菌株[5]。
粘质沙雷氏菌在自然界分布很广，一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。沙雷氏菌是医院内感染的主要致病菌之一，可以引起呼吸道感染、尿道感染和伤口感染等疾病[6]。粘质沙雷氏菌可分为产色素菌株和不产色素菌株，在一定的条件下可以进行转变[7-8]。目前研究已发现，pg合成基因簇包括从piga-pign共14个基因组成，在这十四个基因编码的酶的作用下，前体l-pro, l-ser及2-烯辛醛可以分别先合成两个支线产物：单吡咯环map（2-methyl-3-n-amyl-pyrrole，2-甲基-3-戊基吡咯）和双吡咯环mbc（4-methoxy-2,2′-bipyrrole-5-carbaldehyde，4-甲氧基-2,2′-双吡咯-5-甲醛），其中pigb、pigd和pige基因编码的蛋白是负责合成map的酶，pig基因簇[11]的其它基因，如piga基因以及pigf到pign基因，编码的蛋白直接或间接参与mbc的合成途径的；最后，两条分支途径的产物map和mbc通过pigc编码的缩合酶合成代谢终产物灵菌红素[3]。
由于灵菌红素在医药及工、农业上具有的重要应用价值，因此，为了得到较高产量的灵菌红素，灵菌红素生物合成的研究，尤其是灵菌红素生物合成的调节研究成了热点。已有研究显示，灵菌红素合成的速度和产量对细菌的生理状态及外界环境，如温度，氧供应，ph值，光照和离子强度等变化非常敏感。如改变培养基中碳源和氮源的比例，提供不同含量的无机磷酸盐、其它无机盐及不同的阴阳离子均会会影响灵菌红素的合成；沙雷氏菌在28℃培养时，可以产生较高量的灵菌红素，而在37℃却不能合成灵菌红素[3]。这表明，灵菌红素的合成受到诸多外界和内部因素的影响。虽然目前在灵菌红素的调控方面已有不少的研究，但到目前为止，灵菌红素合成受温度调控的具体原因尚不明确[9]。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标
1.筛选37℃下可以产生灵菌红素的突变体株，并获得温度影响灵菌红素合成的相关蛋白的基因。
2.筛选与抗氧化相关的突变体菌株，并获得与细菌抗氧化相关的基因。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
1．通过在37℃下培养粘质沙雷氏菌FS14观察菌落是否变红，筛选出能够在37℃下产生灵菌红素的突变株。
2．通过对比在含H2O2的相同环境下，野生型与突变株的生长状况，筛选出与抗氧化相关的突变株。
3．细菌总DNA的提取、酶切、自连、转化以及质粒提取；
4．Tn5侧翼DNA插入序列的扩增以及序列分析鉴定；
5．定点突变验证筛选出的参与温度调节灵菌红素合成的调节蛋白基因及与抗氧化相关基因。
6．对突变株功能进行初步研究
二、技术路线
三、实验方案
（一）温度相关的灵菌红素调节基因筛选
1. 筛选
（1） 从-80℃冰箱中的转座子库中，取突变株菌液划在固体LB培养基上，编号，分别置于37℃和28℃培养箱中培养，待菌落形成。
（2） 挑选出37度时菌落仍为红色的突变株。
（二）抗氧化相关基因筛选
1. 菌株初筛
（1） 在96孔板上，每孔加入含有H2O2的M9培养基，接种活化过的菌液，以不含H2O2的M9培养基为对照，每种菌3个重复。
（2） 将96孔板放置于28℃摇床上，90rpm，培养6h。用酶标仪测定吸光度。
（3） 选取吸光度与野生型差别较大的突变株利用纸片法进行下一步研究。
2. 菌株复筛
（1） 将吸光度与野生型差别较大的突变株分别在固体LB培养基上划线，生成单菌落。
（2） 挑取单菌落置于3mL液体LB培养基中，放置于在28℃摇床上，180rpm，培养12h。
（3） 取2mL培养后的菌液于离心管中，12000rpm离心5min，弃废液；用液体M9培养基洗菌2次后置于50mL液体M9培养基中，放置于28℃，180rpm摇床上培养至菌液吸光度达到0.8。
（4） 取达到吸光值的菌液1mL，涂布在固体M9培养基上（每种菌液设置3个），在培养基上放置三个含H2O2的小圆片，放置于培养箱中，比较抑菌圈的大小，验证所选菌株与野生型是否有较大差异。
（5） 重复3次步骤（1）-（4）。
（三）突变株的鉴定
1. 总DNA的提取
（1） 培养至对数中期，离心10min，收菌。
（2） 600μl STE重悬，12000rpm离心5min，收菌。
（3） 250μl STE重悬，加入12μl溶菌酶，加入2.5μlRNase，温浴至溶液变粘稠。
（4） 加入2μl蛋白酶K和13μl 10% SDS至终浓度分别为100μg/ml和0.5%，混匀后有50℃保温6-12h至溶液变清亮。
（5） 加入等体积的酚氯仿，放入冰浴中缓慢摇动1h。
（6） 8000rpm离心10min，吸出上层水相（剪枪头）弃下层。
（7） 重复（5）（6）。
（8） 加入等体积异丙醇，10000rpm离心8min，出现絮状物，弃异丙醇（保留100μl）。
（9） 慢慢加入2倍体积无水乙醇，10000rpm离心8min，弃上清。
（10）用70%乙醇10000rpm离心2min，洗去盐分，在室温下晾干。
（11）溶解DNA于60ml TE，保存于-20℃中。
2. 酶切与自连
（1） 全基因组DNA酶切体系如下:26μl chromosomal DNA,3μl 10 × React Buffer,2μl SacII/ BamHIenzyme(31μl total volume)。酶切体系于37℃反应3h,酶切反应完成后65℃,20min使 SacII失活,或4℃过夜使 BamHI失活。若酶切不完全,可适当加大酶量并延长酶切时间。酵切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。
（2） 在上述酶切产物中加入15μl ddH2O,6μl10×T4 DNA Ligase Buffer,2μl T4 DNA Ligase,混匀后于4℃过夜连接,连接完成后置于65℃,10min使酶失活。
3. 转化
解冻CaCl2法得到的感受态细胞悬液置冰上。加入pBS质粒DNA溶液摇匀,冰上放置后。42℃水浴中热击90秒后迅速置于冰上冷却。向管中加LB液体培养基,混匀后振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态，摇匀后涂布于含Kan的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
4. 质粒提取
取转化子于LB液体培养基中,37℃过夜培养,收集菌体。37℃酶切2h,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,采用1Kb DNA Ladder作为marker指示片段大小。
5. Tn5侧翼DNA插入序列的扩增、测序及序列分析
通过Tn5两端特性引物对提取的质粒进行两端测序。比对测序结果,确定所测片段在FS14基因组中的位置,从而确定Tn5插入位置，初步确定相关基因。
6. 定点突变
利用自杀质粒pWDF，构建FS14无痕缺失株，并利用PCR技术和序列测定对缺失株进行鉴定。
四、可行性分析
本实验室已经了建立一定规模的突变文库，且本实验采用的方法均是成熟的，所以可以为我提供较好的实验基础与便利。同时我对于这个课题有极大的兴趣，兴趣是最好的老师，它可以激励我朝着既定的目标努力，也让我更愿意为之投入更多的时间与精力，能够更好的学习与实践。有老师和实验室的学长学姐们的帮助以及实验室的良好条件，相信我一定会取得圆满的结果。4. 研究创新点
虽然国内外有温度对粘质沙雷氏菌的灵菌红素产量的影响的相关研究，但其受温度调控的具体原因尚不明确；也有一些对沙雷氏菌抗氧化的相关研究，但至今未进行全面的研究。本课题拟将对温度对沙雷氏菌的影响和沙雷氏菌的抗氧化系统进行较为广泛的筛选，以期发现一些与灵菌红素温度调控相关的机制或是从未被发现的抗氧化系统。
5. 研究计划与进展
2019年9月：在实验室进行初步学习，通过与老师和师兄师姐的交流，并且查阅相关文献，大致了解整个实验的流程，熟悉相关实验的基本操作。
2019年10-12月：筛选突变子库，以期筛选出37℃下仍能合成灵菌红素的突变株或是与抗氧化有关的突变株，进行下一步研究。
2020年2-4月：继续筛选突变子库，同时对已筛出的突变株进行dna提取；鉴定相关的基因，对所选基因进行初步研究，研究其与突变株的关系。
