1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
微rna（microrna;mirna)是21个核苷酸（nt）的小rna，在调节基因表达中具有重要功能[1]，[2]。 mirna是衍生自双链前体rna的单链rna分子。在合成过程中，mirna前体在rnase iii酶drosha和dicer的作用下裂解。最后，将成熟的mirna掺入mirna诱导的沉默复合物（mirisc或mirnp）[3]。在mirisc中，mirna直接与argonaute（ago）蛋白家族的成员结合，并起将ago蛋白和mirisc带到mrna上部分互补靶位的指导作用[4]。在募集下游因子后，外切核酸酶可翻译性抑制和/或降解靶mrna [5]，[6]。
实际上，mirna指导的基因调控与所有细胞途径有关。此外，大多数细胞类型（包括免疫细胞，例如dc）都包含特定的mirna特征，有助于建立和维持基因表达程序。因此，这些mirna特征在细胞刺激或分化过程中发生变化，mirna与转录调控结合导致整体基因表达的改变。
基于上述发现，该领域的大多数进展都集中在转录因子和细胞因子的功能上。但许多研究已经证明，microrna也参与了造血谱系分化的调节，例如t细胞，b细胞和nk细胞的分化[7]。一些microrna在dcs的发育和激活中也起作用。用mir-21或mir-34a抑制剂转染单核细胞会部分抑制mddcs（骨髓来源的树突状细胞）分化[8]。与pdcs相比，cdcs中的mir-221和mir-222表达更高。通过使用寡核苷酸激动剂来抑制这两种micrornas在bm细胞中的功能，会增加pdcs / cdcs的比例，这表明mir-221 和 mir222可能促进cdcs的发育[9]。但是，microrna调控dcs发育的方式仍不清楚。
2. 研究的基本内容和问题
本课题着重研究gga-mir-1635及gga-mir-6675这2个鸡的微rna，目标在于寻找并证明这2个微rna在鸡树突状细胞的wnt和ca通路中的靶基因，并初步探究gga-mir-1635及gga-mir-6675调节的这2个通路对鸡树突状细胞发育等功能的影响。
本研究的具体内容有：靶基因的预测和筛选，荧光实时定量pcr初步证明微rna与靶基因相互作用，双荧光素酶报告基因实验进一步证明微rna与靶基因相互作用，蛋白质印迹法探究微rna对相关蛋白表达量的调控，最后通过流式细胞术探究这两个通路对树突状细胞发育的调控。
本实验的关键问题主要在于：1.双荧光素酶报告基因实验中需要用到的突变载体的构建；2.从鸡骨髓中获得足够多的骨髓细胞并将其诱导为树突状细胞，收集到足够多的rna样和蛋白样以进行荧光实时定量pcr和蛋白质印迹法实验；3.蛋白质印迹法操作难度对新手来说较大，耗时较长。
3. 研究的方法与方案
1研究方法
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使用mirdb和targetscan预测gga-mir-1635及gga-mir-6675的靶基因，使用david筛选靶基因；
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荧光实时定量pcr检测mir-1635及mir-6675在鸡髓系树突状细胞中的过表达和抑制对靶基因的mrna含量的影响；
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最近的研究表明Wnt和Ca信号通路在树突状细胞的发育和成熟过程中起到重要作用，Wnt信号主要参与干细胞的分化；而Ca离子信号则负责细胞增殖的调控。同时，也有研究表明microRNA能够调控树突状细胞中的Wnt和Ca信号通路，进而影响树突状细胞的发育、成熟和迁移。但前人还未研究过miR-1635和miR-6675如何通过调控WNT和Ca信号通路，进而调节树突状细胞的发育和成熟。
5. 研究计划与进展
2019.09.01-2019.10.31：树突状细胞经微rna过表达或抑制处理，进行荧光实时定量pcr；
2019.11.01-2019.11.31：树突状细胞经微rna过表达或抑制处理，进行蛋白质印迹法实验；
2019.12.01-2019.12.24：靶基因-pmir载体构建；
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