1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
随着医学的发展进步，体外受精技术解决了很多大龄女性不孕的问题，但是其婴儿的出生率还是比较低，大约只有20%[1]，其中有一部分原因是因为卵母细胞质量下降导致的受精失败或者多精受精。因此卵母细胞成熟机制的研究对解决体外受精和胚胎发育有十分重要的意义。
卵母细胞成熟是指卵母细胞从激活并完成第一次减数分裂，排出第一极体，发育到第二次减数分裂中期的过程[2]。第一次减数分裂期间，卵母细胞完成染色体复制，同源染色体之间的dna片段交换。后期染色质变得疏松，而外面包裹了完整的核膜，这一时期被叫做核网期，这个时候的细胞核又称为生发泡（gv）[3]。卵母细胞将会长时间停滞在生发泡期，进行mrna转录。卵母细胞第一次减数分裂期，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，gvbd)，标志着卵母细胞成熟的开始[4]。在第一次减数分裂前期i中，染色体开始重组，并合成了受精卵或胚胎发育所需要的大部分蛋白质，纺锤体开始组装，进入核的内部，染色体向纺锤体中间位置移动，形成双极纺锤体。原本均勾分布于卵母细胞皮质的微丝系统逐渐聚集，并最终在皮质层形成一个帽状的微丝聚集体，称为微丝帽(actin cap)。两者共同构成了第一次减数分裂中期(mi)的典型形态特征。第一次减数分裂后期时，同源染色体开始分离并且向两极运动，纺锤体的微管拉着同源染色体向两极运动[5] ，拉向每极的为单倍体数量(n)的染色体。在微管牵拉和微丝收缩环的共同作用下，同源染色体完全被分离，卵母细胞发生不对称分裂并排出第一极体[6]。此时卵母细胞变为次级卵母细胞，减数分裂第二次分裂(mii)纺锤体迅速形成。随后小鼠次级卵母细胞停滞在减数分裂第二次分裂的中期，等待受精。
微丝与微丝结合蛋白、肌球蛋白三者构成化学机械系统，产生机械运动。微丝在卵母细胞减数分裂成熟过程中参与了多个细胞学事件的调控：如纺锤体迁移、皮质形成、皮质颗粒不对称分布、极性建立、第一极体排出等[7]。卵丘细胞的扩展依赖于微丝的重组[8]。同时，微丝在gvbd 过程中还与纺锤体、染色体、内质网和中心体等细胞器的位置变化有关[9]。在卵母细胞成熟过程中，微丝的主要功能是牵引纺锤体向皮质边缘移动，并使其定位于皮质区。第一极体排放前，纺锤体的旋转也是受微丝支配的[10]。染色体附近的微丝富集是纺锤体的正确定向和锚依赖于微丝[11]，成熟卵母细胞中微管和微丝的正常组装对于受精的成功是必需的。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目的
探索limk1/2在卵母细胞减数分裂过程中第一极体排出以及对微丝的组装的影响。
2. 内容和拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 卵母细胞的收集和体外培养
实验动物的饲养严格按照南京农业大学动物研究委员会规定的指导方针执行。本研究的实验动物均为4-6周龄性成熟的 icr 雌性小鼠。雌鼠通过断颈法处死后，破开腹腔，将两侧的卵巢拿镊子和剪刀摘取下来，放入预热好的体外操作液 m2 液滴中，用酒精消毒后的刀片将卵巢剁碎，在显微镜下用口吸管捡取 gv 期卵母细胞，用m2洗净后，将gv期卵母细胞加入预热好的体外培养液m6液滴中，覆盖石蜡油，放入37℃的co2培养箱中培养9h或12h以达到减数分裂mi或mii期，用于后续的实验等。
4. 研究创新点
微丝也称肌动蛋白，是细胞骨架的组成之一，参与卵母细胞减数分裂成熟过程中纺锤体向皮质区的迁移以及卵子极性的产生和维持。细胞骨架对哺乳动物卵母细胞正常发育和受精起着十分重要的作用。近年来，借助于对细胞周期调控研究所取得的成果，以及生化分析与胚胎学的结合，使人们得以在分子水平上描述参与调节卵母细胞成熟和受精中细胞骨架系统的信号途径。LIMK蛋白通过调节cofilin家族蛋白的活性而影响肌动蛋白细胞骨架结构，在调节细胞运动和分裂中发挥着不可替代的作用，对细胞形态、黏附以及迁移同样至关重要。目前，国内关于LIMK蛋白的研究主要集中于其在肿瘤细胞迁移过程中的作用，对LIMK蛋白在卵母细胞成熟中的研究尚未见报道。本实验拟通过研究LIMK对卵母细胞减数分裂过程中微丝的组装及卵母细胞极体排出的影响，为后续相关研究提供理论基础。
5. 研究计划与进展
2015年9月至2015年12月：练习并掌握卵母细胞的采集以及体外成熟培养，免疫荧光染色及激光共聚焦等技术手段的操作。
2016年1月至2016年3月：完成全部主体实验
2016年4月至2016年5月：毕业论文撰写，并准备答辩等相关事宜。
