1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1本课题的意义 鸡球虫病是一种由孢子虫纲艾美尔球虫属球虫引起的严重危害养鸡业的常见疾病。属于鸡场多发病。常见的鸡球虫有七种，包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫(E. mitis)和早熟艾美耳球虫。有研究对江苏地区18个鸡场鸡球虫感染情况进行了流行病学调查，其感染率为66. 7%。经过ITS1-PCR检测，阳性样品多呈几种艾美耳球虫的混合感染。其中，柔嫩艾美耳球虫感染率最高，达91.7%，是江苏地区的优势种；和缓艾美耳球虫(E. mitis)为50. 0%[1]。 目前鸡场控制球虫病仍以药物为主，长期用药导致耐药虫株和药物残留普遍产生[2]。鸡感染球虫后可引起鸡对其他病原感染的抵抗力下降或诱导继发其他病原感染，如柔嫩艾美尔球虫感染可以诱导肠炎沙门菌感染。鸡感染球虫后其料肉比下降明显，并可能出现长期带虫的现象，一旦混群饲养易致大规模爆发，从而引起养鸡业的巨大损失。免疫预防是针对该病的理想方法。 其中鸡球虫 DNA 疫苗是将编码球虫抗原的基因直接与 DNA 表达载体连接，构建重组DNA 表达质粒，直接用此重组质粒免疫鸡，具有免疫原性的蛋白抗原基因在鸡体内直接表达，这种表达的蛋白与原核表达的蛋白比较能够形成正确的折叠包含翻译后加工修饰过程，更接近其天然构象，能被免疫系统识别从而达到免疫保护的效果[3]。而传统疫苗稳定性差，需低温保存，弱毒疫苗有返强可能。与传统疫苗相比DNA疫苗则具有如下优点：一、免疫效果更好。二、核酸疫苗与减毒活疫苗和载体活疫苗一样引起CTL应答，产生全身性保护性免疫反应，但却不存在后两者毒力回升的危险，也不存在散毒，病毒污染及个体传染源的敏感性相关的毒力改变，对于常规疫苗难以培养或危险的致病性，同时核酸疫苗则易于构建。三、免疫应答持久。四、激机体产生强而持久的比其它疫苗更经济。五、使用更安全。六、DNA疫苗具有相同的理化性质，容易制成多联多价疫苗，易与其他疫苗联合使用以增强免疫效果，为联合免疫提供了可能。七、核酸疫苗有一定的稳定性，可以加工成干粉样剂型便于贮藏和运输[4-6]。 过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin，prx) 家族是细胞中一类高含量蛋白质，基础功能是维持体内过氧化氢水平。此外还具有细胞增殖，分化和凋亡、细胞信号转导及增加其它蛋白的稳定性等[7]。本课题根据实验室前期研究的结果选取和缓艾美尔球虫过氧化物酶(Peroxiredoxin)基因进行克隆表达，以期为获得有效的控制鸡和缓艾美尔球虫的DNA疫苗进行前期准备，为鸡球虫的防治工作提供有力的支撑。1.2国内外研究概况 目前已报道的抗原基因主要来源于E.tenella、E.acervulina、E.praecox 和E.maxima4种球虫，候选基因包括这些虫体的一些持家基因、各阶段虫体基因及细胞器的一些 DNA 或cDNA片段。近几年人们又用各种方法发现了许多新的球虫抗原基因,如WF-I、WF-II、cGMP（cyclic guanylic acid）依赖蛋白激酶(Protein kinase,PKG)基因、LMW、GAM56、GAM82和微线蛋白基因MIC-1、MIC-2、MIC-3、MIC-4、MIC-5等[8]。在我国，鸡球虫核酸疫苗的研究起步虽然较晚，但已有不少学者已对这方面做出了基础性的研究。姜荣芝对四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序的研究表明免疫调节型多价多表位DNA疫苗p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的免疫效果在毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫免疫保护效果最好的免疫剂量均为10μg，柔嫩艾美耳球虫组免疫保护效果最好的免疫剂量为25μg, 各免疫攻虫组中腿部肌肉注射组ACI均最高。加强免疫组比非免疫组免疫保护效果好，所有加强免疫组的ACI都大于16。各免疫组中二周龄首免组比一周龄首免组免疫保护效果好，而二周龄首免三周龄加强免疫组效果最好[9]。 对Prx蛋白国内外对细胞的影响已有初步研究，Woo 等人发现，Prx蛋白影响H2O2的浓度，HepG2 细胞在受到某些刺激，激活相应的受体时，细胞内至少存在两种机制能够有效地将高浓度的H2O2 限制在细胞膜的部分区域，而尽量减少对整体细胞的影响。这些受体有生长因子受体，如血小板衍生生长因子受体、表皮生长因子受体和免疫受体，如T 细胞抗原受体、B 细胞抗原受体[10]。在真核生物中，p38/JNK 是重要的应激活化蛋白激酶，p38/JNK 信号通路参与了包括氧化应激在内的多种细胞应答过程。ElizabethA. Veal 等人研究发现，在粟酒裂殖酵母中，Tpx1（酵母中Prx1的同系物）对于过氧化物诱导的Sty1（酵母中p38/JNK 的同系物）的活化是必需的[11]。对于高等哺乳动物而言，血管内膜巨噬细胞在吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白后会导致巨噬细胞内脂质的堆积，形成所谓的泡沫细胞。而泡沫细胞能够上调细胞因子的产生，引起单核细胞/ 巨噬细胞的额外募集以及平滑肌细胞的增殖，因而可以明显地加速动脉粥样硬化的形成。近来有研究发现，Prx1 的表达量在该过程中存在着明显的上调[12]。肿瘤和癌症与细胞的氧化还原状态相关。有研究表明Prx 1 表达增高可能与烟草诱导的氧化应激有相关性，在烟草诱导的口腔鳞状细胞癌发生发展中可能发挥重要作用[13]。在二阶段化学诱发鼠肝癌形成过程中Prx2的高表达是化学诱发小鼠肝癌形成的早期事件，Prx2 可能在化学诱发小鼠肝癌的发生、发展和促进过程中起重要作用[14]。有实验证实MCF-7 细胞受过氧化氢刺激后，Prx1 和Prx2 在mRNA 和蛋白质水平均有升高。Prx1 和Prx6 在人的膀胱癌细胞中表达量明显增加[15]。1.3应用前景 Prx蛋白在细胞中含量表达丰富，批量生产可一定程度上降低成本，有实际应用价值。参考文献[1] 张新宇. 和缓艾美耳球虫与早熟艾美耳球虫江苏株的分离鉴定及其生物学特性研究[D].南京农业大学,2011:36-38[2] 马立农，陈杖榴. 柔嫩艾美耳球虫对地克珠利和百球清的交叉耐药性检验[J].中国兽医杂志, 2003,39(11): 6-9.[3] 李学钊，宋鸿雁，刘根新，李祥瑞. 鸡球虫DNA疫苗研究进展[J]. 畜牧与兽医,2011,08:95-99.[4]Srivastaval K, Liu MA. Genevaceines[J]. Ann Intem Med, 2003, 138(7): 550-559.[5]DonnellyJJ,WahrenB,LiuMA.DNA vaccines: progress and challenges[J]. Immunol, 2005, 175(2): 633-639.[6]杨汉春.动物免疫学[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2000.[7] 章波，向渝梅，白云. 抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究进展[J]. 生理科学进展，2004，04:352-355.[8] Robert G K,Donald,P A.Molecular characterization of a coccidian parasit cGMP deoendent protein kinase[J].Molecular and Biochemical Parasitology, 2002,120:165-175.[9] 姜荣芝. 四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究[D].南京农业大学，2012:111-113 [10] Woo, H.A., et al. Inactivation of peroxiredoxin I by phosphorylation allows localized H2O2 accumulation for cell signaling [J]. Cell, 2010,140(4): 517-528[11] Veal, E.A., et al. A 2-Cys peroxiredoxin regulates peroxide-induced oxidation and activation of a stress-activated MAP ki nase [J]. Mol Cell, 2004, 15(1): 129-139[12] Conway, J.P. and M. Kinter. Proteomic and transcriptomic analyses of macrophages with an increased resistance to oxidized low density lipoprotein (oxLDL)-induced cytotoxicity generated by chronic expo-sure to oxLDL[J]. Mol Cell Proteomics, 2005, 4(10): 1522-15240 [13] 赵艳华,汤晓飞,张敏. 尼古丁上调口腔鳞状细胞癌抗氧化蛋白Prx1的表达[J]. 口腔医学研究, 2010,03:336-339.[14] 黄雪. 二阶段化学诱发小鼠肝癌形成过程中PRX2，AKR1B10，E-FABP和67LR的表达研究[D].广西医科大学,2014: 28-43[15] Quan C et al. Enhanced expression of peroxiredoxin I and VIcorrelates with development, recurrence and progression of human bladder cancer. J Urol, 2006, 175: 1512-1516
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标 本实验对和缓艾美尔球虫的过氧化物酶peroxiredoxin进行克隆和序列分析，后期希望构建原核表达载体，对表达产物进行纯化，为球虫基因工程疫苗奠定基础。
2.2研究内容（1）基因克隆：提取总mrna，克隆目的基因（2）原核表达载体的构建：重组质粒克隆入原核表达载体pet32a，构建pet32a-prx重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌bl21，培养后用pcr和双酶切试验进行鉴定。（3）重组蛋白的表达与鉴定：转化后的重组质粒用iptg进行诱导表达，然后用sds-page电泳检测重组蛋白的表达情况。（4）对重组蛋白活性进行测定，研究其活性对温度和ph的影响。
2.3拟解决的关键问题(1) 设计出特异性引物，据此选择合适的dna聚合酶和连接酶。(2) 摸索出最优pcr 反应条件，以提高基因的克隆率。(3) 成功将基因与载体连接并转化入感受态细胞，使其表达顺利进行。。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法 本实验利用rt-pcr的方法对和缓艾美尔球虫的过氧化物酶peroxiredoxin进行克隆和序列分析，后期希望构建原核表达载体，对表达产物进行纯化，并分析温度和ph对酶活的影响，为研制球虫基因工程疫苗奠定基础。
3.2技术路线
4. 研究创新点
4.特色或创新之处创新 国内很少有人研究和缓艾美耳球虫，目前E.mitis感染的防治只是囊括在防治各种危害严重的球虫感染方案之内，并没有比较针对性的治疗方法，所以本实验的研究将对于和缓艾美耳球虫重组疫苗的研究提供候选基因。
5. 研究计划与进展
2015年9月 资料查找2015年10月 复苏和缓艾美尔球虫卵囊，对鸡接毒、收集粪便，分离卵囊。提总RNA,对和缓艾美耳球虫过氧化物酶(Peroxiredoxin)的克隆、鉴定及序列分析2015年11月 E. mitis过氧化物酶(Peroxiredoxin)基因的原核表达及表达产物的纯化2015年12月 表达产物的酶活测定以及温度，Ph对酶活的影响。2016年1月 撰写论文
