1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 课题的意义
养羊业是畜牧业的重要组成部分，不仅为市场提供丰富的肉、毛、绒、皮和乳等畜产品，而且能帮助农、牧民脱贫致富。湖羊是我国宝贵的绵羊品种，具有繁殖力高、耐粗饲和适应性强等特点。近年来随着我国肉羊产业的发展，湖羊养殖量的增多，在饲养管理中也暴露出一些问题，如春冬季节饲料资源缺乏，导致湖羊营养摄取不足，体质瘦弱和生长机能减退等，严重制约着湖羊养殖的效益。
肝脏是机体主要的代谢器官，具有分泌激素和酶、分解脂类物质、贮存糖原及造血等功能，在生物合成和免疫防御方面也具有重要作用。因此，正常的肝脏功能对于机体的生长发育具有重要作用。有研究表明，能量限制主要通过影响肝脏组织的代谢而参与机体发育的调节，适当水平的营养限制后再补偿，可促进个体的发育。然而，我国肉羊的饲养管理中，湖羊的补偿生长能力并未得到很好重视和利用，并且补偿生长的调控机理尚不完全清楚。因此，研究湖羊营养受限与补偿的调控机理，为湖羊科学饲养管理提供理论依据具有重要意义。
2 国内外研究进展
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标本研究以营养限制及限制后补饲的湖羊肝脏为对象，通过qrt-pcr、westernblot及免疫组化等方法探究hippo通路相关基因和蛋白在湖羊补偿生长过程中的表达变化，为湖羊的科学合理饲养提供理论依据。
2 研究内容
在能量限制和补偿饲喂结束后，屠宰湖羊并立即采集湖羊肝脏组织及称重：（1）通过检测湖羊肝脏氨基转移酶活性来判断各组肝脏是否损伤；（2）提取肝脏组织mrna，通过qrt-pcr检测hippo通路核心基因及prkaa1基因在能量限制与补偿生长湖羊肝脏组织中的表达变化；（3）提取各组肝脏组织蛋白质，通过western blot检测yap1、ampk和pampk蛋白在能量限制与补偿生长湖羊肝脏组织中的表达情况；（4）通过免疫组化法检测yap1和ampk蛋白在能量限制与补偿生长湖羊肝脏组织中的表达定位。
3. 研究的方法与方案
1 研究方法本试验在江苏省泰州市海伦羊业有限公司进行。选取32只体重相近、体况良好、系谱清楚、相同遗传背景的3月龄湖羊公羔，随机分为两组（对照组和补偿生长组，体重分别为22.39 ± 0.54 kg 和 22.27 ± 0.64 kg，每组16只）。所有试验羊均采用分栏饲养，每天饲喂两次（08:00和16:00），自由饮水。试验日粮营养水平参考《NY816-2004肉羊饲养标准》，配制颗粒饲料，预混料由北京精准动物研究中心提供，日粮组成及营养水平见表1。
表1 日粮组成及营养水平（风干基础，%）
Table 1 Composition and nutrientlevels of diets (DM basis, %)
| 项目 Items （%） | 限制期Restriction period | 补偿期 Compensation period | |
| 对照组Control group | 限饲组Restriction group | ||
| 大麦Barley husk | 0.00 | 0.00 | 26.00 |
| 稻草Rice straw | 0.00 | 64.00 | 0.00 |
| 豆秸 Soybean straw | 30.00 | 0.00 | 0.00 |
| 木薯渣 Cassava residue | 12.00 | 4.00 | 21.00 |
| 玉米 Corn | 28.00 | 0.00 | 18.00 |
| 豆粕Soybean meal | 18.00 | 23.00 | 23.00 |
| 麸皮Corn bran | 8.00 | 5.00 | 7.00 |
| 1预混料Premix | 4.00 | 4.00 | 5.00 |
| 合计 Total | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
| 营养成分 Composition |
|
|
|
| 粗蛋白CP | 15.19 | 15.17 | 15.62 |
| 粗脂肪EE | 2.48 | 0.71 | 2.18 |
| 粗纤维CF | 60.64 | 60.33 | 57.01 |
| 2代谢能ME（MJ/ kg） | 11.64 | 6.84 | 12.86 |
注：1）1预混料为每千克饲料提供：Fe 56 mg; Cu 15mg; Mn 30 mg; Zn 40 mg; I 1.5 mg; Se 0.5 mg; Co 0.25 mg; S 3.2 g; vitamin A2150 IU; vitamin D 170 IU; vitamin E 131 IU; 超浓缩源康宝 2.7 g；2%莫能霉素 1.6 g；硫酸钠 10.1 g。
1) 1The premix provided the following per kg of diets: Fe 56mg, Cu 15 mg, Mn 30 mg, Zn 40 mg, I 1.5 mg, Se 0.5 mg, Co 0.25 mg, S 3.2 g,vitamin A 2150 IU, vitamin D 170 IU, vitamin E 131 IU, super concentratedYuanKangbao 2.7 g, monensin (2%) 1.6 g, sodium sulfate 10.1 g.
2) 所有成分均是根据原料计算所得。表中除了代谢能数值，其余成分均显示为百分比（%）。
2) All ingredients are calculated according to the raw material. Exceptthe ME value, the ingredients are shown as percentage (%).
3) 2根据中国饲料成分及营养价值表（2012，第23版，中国饲料数据库）计算。
3) 2 Calculated according to the table of feed composition and nutritive valuesin China (2012, twenty-third edition, Chinses Feed Database).
将试验分为限制饲养（60 d）和补偿饲养（90 d）两个阶段，试验羊在预饲15 d后开始正式试验。能量限制阶段对照组和试验组日粮的代谢能分别为11.64 MJ/kg和6.84 MJ/kg，能量补偿阶段日粮的代谢能为12.86 MJ/kg。在正式试验的第60 d和150 d早晨饲喂前称取各试验羊的体重。在能量限制和补偿饲喂结束后，对照组和实验组各随机挑选8只羊进行屠宰，屠宰前禁食24 h，禁水12 h。屠宰结束后立即取出肝脏组织称重，并采集同一部位肝脏样品。一部分样品保存于4 %多聚甲醛中，经石蜡包埋后进行免疫组织化学检测；另一部分样品立即冻存于液氮中，用于后续RNA和蛋白提取，进行qRT-PCR，Western blot和氨基转移酶活性等检测。
（1）肝脏组织氨基转移酶活性检测：称取相同重量的冻存肝脏组织，匀浆后离心取上清，按照Sigma公司的天冬氨酸氨基转移酶活性测定试剂盒和丙氨酸氨基转移酶活性测定试剂盒检测样品中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的活性。测定方法严格按照试剂盒说明书进行。
（2）RNA提取、反转录与实时定量PCR检测：用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取肝脏组织总RNA，经过RNA均一性和完整性检测合格后，按照Takara公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据NCBI提供的序列信息，通过primer-blast设计各目的基因MST1、MST2、LATS1、LATS2、YAP1和PRKAA1的引物。以cDNA为模板，进行目的基因的qRT-PCR检测。加样体系为：SYBR Green Master 10 μL、上下游引物各0.6μL、cDNA 1 μL、补加超纯水至 20μL。反应条件为：95 ℃预变性10min；然后95 ℃ 15 s、60 ℃30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环，接着72 ℃延伸10 min。PCR程序结束后，绘制熔解曲线，以GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)作为内参基因，检测不同处理组肝脏中目的基因的差异表达。为了便于不同处理组之间的比较，将能量限制阶段对照组羔羊肝脏组织中目的基因表达量的平均值设置为1.00。
（3）Westernblot检测：用碧云天公司的RIPA强裂解液提取肝脏组织总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒（No.P0010）检测蛋白浓度后进行蛋白变性处理。30 μg (20 μL)的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转膜，并用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h。一抗（抗YAP/YAP1抗体，1：2000稀释；AMPKα1 多克隆抗体，1：1000稀释；磷酸化AMPKα (Thr172) 抗体，1：1000稀释；抗GAPDH抗体，1：2000稀释） 4 ℃孵育过夜后，二抗（HRP标记羊抗兔IgG， 1：2000稀释）室温孵育2 h。用ECL发光液（Advansta）显影并拍照。拍照后通过Image J软件进行灰度分析。
（4）免疫组化法检测：4 %多聚甲醛固定的肝脏组织石蜡包埋后进行组织切片（7 μm）。石蜡切片经脱蜡复水处理后，抗原修复10 min并自然冷却至室温。通透后用3 %甲醇-过氧化氢处理20 min。室温封闭1 h后，一抗（抗YAP/YAP1抗体，1：200稀释；磷酸化AMPKα (Thr172) 抗体，1：100稀释）4 ℃过夜孵育。经DPBS洗涤后，二抗（HRP标记羊抗兔IgG， 1：2000稀释）室温孵育2 h。DAB染色后用苏木素复染，脱水透明处理后封片镜检。阴性对照为一抗来源动物（兔）的血清代替一抗，其余步骤一样。
（5）数据的处理与统计分析：所有试验至少重复3次。试验数据先用Excel处理，并用SPSS18.0软件进行描述性分析（检验其是否符合正态分布），然后用t检验进行显著性分析。试验结果以平均数 ± 标准误表示，P 0.05表示差异显著。
2 技术路线
3可行性分析
本试验拟在南京农业大学江苏省肉羊产业工程技术研究中心进行，该实验室仪器设备先进齐全，技术力量强，将在王锋教授团队的指导下完成，具备了进行本试验研究的基本条件。
4. 研究创新点
本研究以不同能量水平饲喂的湖羊为对象，探究不同能量水平对湖羊肝脏生长发育的影响，并从分子水平上揭示能量限制和补偿调节湖羊肝脏发育的可能机制，为湖羊的科学饲养提供一定的理论依据。
5. 研究计划与进展
2018.03-2018.04 采集样品并完成相关文献资料的查阅；2018.05-2018.06 检测肝脏氨基转移酶活性；完成不同处理组hippo通路核心基因及prkaa1基因表达的研究（完成qrt-pcr检测试验）；
2018.07-2018.08 完成不同处理组yap1、ampk和pampk蛋白表达变化的研究（完成western blot检测试验）；
2019.02-2019.05 研究yap1和ampk蛋白在能量限制与补偿生长湖羊肝脏组织中的定位情况（完成免疫组化试验）；统计分析试验数据、撰写论文并准备答辩。
