1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
叶片通过降低气孔开度以减少由于蒸腾作用导致的水分散失从而保存现有的水分，是植物面对缺水胁迫所进化出的重要适应性功能。多年来，负责传导根部的缺水信号到叶部的信号分子尚未被完全理解，并且一直是被广泛热议的主题。针对于此，在过去几年里国内外的学者们已经提出了许多假设比如：液压信号，电信号，包括脱落酸（aba）在内的化学信号，木质部汁液的ph，独脚金内酯和钙离子。直到2018年，takahashi在nature上发表的一篇文章首次揭示出，小肽也可以作为细胞间互作的重要介质。
现阶段小肽作为重要的细胞-细胞间通讯信使已经引起国内外众多研究团队的重视，但对于clavata3/esr (cle)家族之外的小肽家族作为信号分子的功能却知之甚少。探索小肽在氢气缓解的植物干旱胁迫的分子机制，不仅可以完善植物体内复杂的信号调解网络；还有利于通过外源手段调节和缓解实际生产中非生物逆境对植物生理上带来的不利影响，从而有助于人们开发新的栽培手段、培育新型栽培作物和研究绿色农药，提高粮食产量与质量，同时也有利于环境保护。
2. 研究的基本内容和问题
本课题的主要研究目标是探究包括CLAVATA3/ESR (CLE)家族在内的有关拟南芥抗干旱胁迫和盐胁迫的小肽家族成员是否能够在氢气缓解的由高浓度甘露醇引起的渗透胁迫中发挥调节作用。
其内容可以分为三个部分：第一，观察由250 mM浓度的甘露醇引起的渗透胁迫所导致的拟南芥野生型和HYD1转基因拟南芥的表型变化；第二，以未施加渗透胁迫的处理为对照，探索有关拟南芥抗干旱胁迫和盐胁迫的小肽家族成员基因表达水平的变化，从而在转录层面上获得氢气是否能够影响干旱胁迫下某些小肽的基因表达水平；第三，基于上述内容成立的条件下，即HYD1过表达能够导致某些小肽的基因表达水平发生变化，进一步通过对野生型株系外源施加富氢水或对HYD1过表达突变体株系施加DCPIP（氢化酶抑制剂），联用质谱探究氢气在干旱胁迫条件下对小肽蛋白表达水平上的变化和影响，进而确定小肽与氢气在信号调节网络中的上下游关系。
3. 研究的方法与方案
本课题实验方案具有较强的可行性和可操作性。首先，利用实验室中现有的野生型和Hyd1过表达转基因拟南芥株系进行培养，对幼苗分别进行施加由250 mM浓度的甘露醇引起的渗透胁迫和无渗透胁迫的阴性对照处理，5 d后观察植株整体的表型差异。并利用TRIzol法提取植物的总RNA以进行后续的反转录PCR，合成cDNA的第一链，设计特异性引物并进行荧光定量PCR从而获得相关目标小肽基因的相对表达量。通过在野生型拟南芥渗透胁迫培养环境中回补富氢水，或者在HYD1过表达转基因拟南芥株系的渗透胁迫培养环境中添加DCPIP（氢化酶抑制剂）可以进一步验证氢气对植物抵抗非生物逆境和对目标小肽表达的作用。经过上述实验设计，便可以通过结果判断出渗透胁迫与某些小肽基因表达的相关关系；除此之外，实验室配备有上述的所有技术的商业化试剂盒，生命科学学院实验中心配备有完成实时荧光定量PCR的仪器。
由于小肽具有较小的蛋白分子量，因此很难通过常规的SDS-PAGE凝胶分离检测出小肽的蛋白表达含量。同时由于时间关系的限制，制备不同小肽的特异性抗体或探针以进行后续的Western Blot或者杂交实验都不具有较强的可操作性。但是，通过质谱结合小肽的蛋白分子量，还是可以观测到小肽在上述条件下蛋白表达含量的变化。从而推测出肽与氢气在信号调节网络中的上下游关系。生命科学学院实验中心配备有完成质谱的仪器。4. 研究创新点
首先，氢气在植物抗胁迫中具有重要的作用，如抵抗干旱环境，减轻盐胁迫带来的氧化损伤，减轻重金属毒害带来的氧化损伤，参与激素抗病虫害信号相关基因的表达。氢气不仅可以作为新兴的新兴能源，还可以作为小分子气体参与植物体内的新陈代谢。通过加强氢气参与植物抗胁迫机理的研究，不仅有利于理解植物在抗胁迫环境中的分子机理与生理变化，还将有助于氢气在生物学上的广泛应用。从而实现在未来农业生产上，减少化学农药的使用、增强植物耐受度，为保护环境和促进农业的可持续发展做出贡献。
其次，探索小肽在氢气缓解的植物干旱胁迫的分子机制，不仅可以完善植物体内复杂的信号调解网络；还有利于通过外源手段调节和缓解实际生产中非生物逆境对植物生理上带来的不利影响，从而有助于人们开发新的栽培手段、培育新型栽培作物和研究绿色农药，提高粮食产量与质量，同时也有利于环境保护。
5. 研究计划与进展
实验可以分为三个阶段，首先通过查阅文献，检索与了解不同小肽家族在拟南芥根部发育成熟以及抵抗非生物胁迫，尤其是干旱胁迫和盐胁迫中的作用。进而推测和确定目标小肽，并获取基因序列以进行后续的特异性引物设计。其次，利用实验室中现有的野生型和HYD1过表达转基因拟南芥株系进行培养，对幼苗分别进行施加由250 mM浓度的甘露醇引起的渗透胁迫和无渗透胁迫的阴性对照处理，5d后观察植株整体的表型差异。并利用TRIzol法提取植物的总RNA以进行后续的反转录PCR，合成cDNA的第一链，设计特异性引物并进行荧光定量PCR从而获得相关目标小肽基因的相对表达量。通过在野生型拟南芥渗透胁迫培养环境中回补富氢水，或者在HYD1过表达转基因拟南芥株系的渗透胁迫培养环境中添加DCPIP（氢化酶抑制剂）可以进一步验证氢气对植物抵抗非生物逆境和对目标小肽表达的作用。
最后，由于小肽具有较小的蛋白分子量，因此很难通过常规的SDS-PAGE凝胶分离检测出小肽的蛋白表达含量。同时由于时间关系的限制，制备不同小肽的特异性抗体或探针以进行后续的Western Blot或者杂交实验都不具有较强的可操作性。但是，通过质谱结合小肽的蛋白分子量，还是可以观测到小肽在上述条件下蛋白表达含量的变化。从而推测出肽与氢气在信号调节网络中的上下游关系。
