1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
crispr-dcas9介导的转录激活系统
crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /cas (crispr-associated gene)系统来源于细菌防御噬菌体的免疫机制，是一种在真核生物中迅速广泛应用的基因定点编辑工具。工程化的crispr系统通过转录形成单一的sgrna (single guide rna, sgrna)与cas9基因表达形成的核酸酶形成复合体起到基因定点编辑的作用。
近年来gilbert等的研究将cripsr技术作为基因组编辑工具,使用由sgrna引导的催化失活的cas9（defective cas9, dcas9）融合蛋白，将激活蛋白（activator）或阻遏蛋白（repressor）效应结构域定位于特定dna序列，以抑制（crispri）或激活（crispra）靶基因的转录和表达。从而广泛调控内源基因的转录水平[1]。因此，在基因组范围内的由dcas9介导的基因抑制或激活系统不仅可以通过缺失功能和获得功能的方式（loss of function and gain of function）研究耙基因的功能。除此之外，利用该系统可以通过构建定位于特定基因转录起始区域的多个sgrna形成的文库，反映出在定位耙基因不同区域的sgrna介导的转录蛋白对耙基因功能调节程度和相互作用的强弱。
2. 研究的基本内容和问题
毕业实习的研究目标是建立crispr-dcas9介导的转录激活系统中诱导表达系统和分子开关的部分。我们基于crispr-dcas9在植物基因组的转录表达过程中激活效果，试图在此基因表达调控系统的基础上建立受小分子物质调控的诱导体系。该组分在相应不同浓度的雌激素诱导时，可以起到分子开关的作用调控下游crispr元件的表达，启动或加强基因编辑调控的效果。
我们试图将已经报道的lexa-vp16-er（xve）植物诱导表达系统应用于crispr-dcas9元件中。该基因表达xve转录因子融合蛋白，当细胞中受到雌激素诱导时该转录因子即与其结合并共同靶向目的基因lex operator操纵基因上，启动下游crispr基因编辑系统的表达。在植物生产应用中可以起到对某一时期或生长阶段的植物作物进行人为喷施诱导物质，起到基因特异性编辑和调控的效果，将在植物科学研究和生产实际中将会有较大的应用价值。
3. 研究的方法与方案
4. 研究创新点
本课题的创新之处是通过建立一种受小分子诱导的新型植物表达体系，这个体系能够起到分子开关的作用来调控转录激活系统的表达。
我们试图构建lexa-vp16-er植物诱导表达体系对crispr系统起到子开关的作用。在植物生产应用中可以起到对某一时期或生长阶段的植物作物进行人为喷施诱导物质，起到基因特异性编辑和调控的效果，将在植物科学研究和生产实际中将会有较大的应用价值。
5. 研究计划与进展
2019. 2. 20-2019. 3. 17植物诱导表达体系载体的构建(1300 lexa cas9 gfp e9t、1300 lexa cas9 gfp xve、1300 lexa cas9 gfp xev)
2019. 3. 18-2019. 3. 31原生质体瞬时表达实验(质粒的大量提取、原生质体的制备与转化、雌激素诱导实验)
2019. 4. 1-2019. 5. 10拟南芥植株稳定转化实验(培育野生型拟南芥幼苗、农杆菌侵染、rt-pcr、表型分析)
