1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1本课题的意义
烟草是我国主要的经济作物之一，南北各省广为栽培。[1]烟草在种植过程中极易出现病虫害，使得烟叶的产量和品质都会受到影响，造成巨大的经济损失，其防治研究具有重要的现实意义。[2]
2国内外研究概况
2. 研究的基本内容和问题
1研究内容及目标
试验bs对烟草青枯菌的抑制效果，并将bs应用到被青枯菌感染的烟草苗上定期观察统计烟草发病率，实测每个处理组烟草产量，对烟草青枯病防治效果评价，以期对烟草青枯病的生物防治提供一些出路，用以指导皖南烟区的烟草生产。
2拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
1研究方法
粘细菌BS及青枯菌的活化培养、BS菌对青枯菌的捕食能力评估、漂浮育苗法对烟草进行育苗、采用土壤灌根接种法对烟草苗接种BS菌悬液、对烟草苗进行植物学性状及生物量的测定。
2技术路线
3 实验方案
1）粘细菌BS的活化培养：将甘油保藏的粘细菌BS菌株穿刺接种在VY/4固体培养基上，菌落接种处添加灭菌兔粪诱导，30℃培养2到3天至菌落扩散，用接种环刮取部分扩散的菌落转接到新的VY/4固体培养基上活化一次，30℃温箱内培养2到3天；
2）烟草青枯菌的活化培养：在YGPA固体培养基上接种青枯菌，以三区划线方式分离纯化，30℃温箱内培养1到2天至菌落扩散生长，挑选单菌落，转接至YGPA液体培养基摇菌扩繁，30℃温箱内培养12h。
1）青枯菌悬液制备：在YGPA固体培养基上用接种环挑取烟草青枯菌单菌落，接种于5mL灭菌后的YGPA培液体培养基的试管中，30℃摇菌过夜培养，制成种子液，接着将种子液以1的接种量接种于100mL的YGPA液体培养基中，在30℃，180rpm摇床培养 2天后, 以8000rpm离心10min，收集沉淀，然后加入无菌水重悬，使用显微镜血球计数板法计算菌体浓度，稀释到浓度108cfu/mL，备用。
2）BS菌悬液制备：将诱导活化后的菌株BS接种到5mL灭菌LBS液体培养基试管中，30℃培养 1到2 天，待试管中细菌贴壁生长后以1的接种量接种于100mL的LBS液体培养基中，在30℃，180r/min摇床培养 2天。由于粘细菌BS在生长的过程易聚集难以分散，导致无法准确确定其菌体密度，因此采取离心收集菌体通过测定菌体鲜重，用无菌水重悬，最终确定菌悬液中菌体的浓度为0.005g/ml,备用。
1）200ul青枯菌悬液点到LB培养基平板，吹干后在菌苔中心接种3ul BS菌悬液，吹干，30℃培养 2-3d，观察粘细菌扩散速度，待粘细菌扩展覆盖整个菌苔，刮取菌苔，梯度稀释法制备10-1-10-7浓度的菌悬液，在LB固体培养基上稀释涂布计算青枯菌残留活菌数。对照为200ul青枯菌悬液点到LB培养基平板上后吹干，在30℃培养2-3天。为了评估实验结果在应用价值，以同样的方法使用测定了农用链霉素对青枯菌的抑制效果。
2）将BS菌接种到 LBS液体培养基中，于30℃培养到稳定期，12000rpm, 4℃条件下离心20min,，收集上清液，将上清液与青枯菌共培养，在30℃温箱中静置培养16h。在LB固体培养基上稀释涂布计算青枯菌残留活菌数。以青枯菌为对照。
1）苗盘、育苗基质灭菌：将育苗基质按照蛭石：珍珠岩：培养土113比例混合均匀后，121℃灭菌2h，晾干后重复灭菌2-3次，干燥待用。购买干净新苗盘，用干净的水配制浓度为30有效氯的漂白粉20倍液，将干净的苗盘放入贮有漂白粉溶液的水池中浸泡15到20分钟。（或者浸入后将苗盘捞起，沥干水后整齐地码放在平坦洁净的地方20分钟），然后用清水将育苗盘冲刷干净晾干备用。
2)基质装盘装盘的场地保持干净，平坦。装盘的原则是：基质均匀一致，松紧适度。装盘前给基质喷洒少量的水并搅拌，让基质稍微湿润，使基质含水量大约30-40％，最适宜烟草种植。然后在苗盘上方约30cm处将基质均匀洒落，像这样反复进行几次，使每个苗穴的基质装填均匀一致。装填过程中不要拍压基质，以防装填过于紧实。
3)播种装盘后在每个苗穴的中心位置压出整齐的小穴，然后用播种盘在每个穴播1-2粒包衣烟草种子，之后喷洒清水促进种子裂解，然后用筛子筛下约2-5mm薄的基质盖在上面，使包衣种子隐约可见。喷洒适量清水在烟草种子表面，帮助种子开裂，从而减少育苗时间。
1) 试验设计
表1 试验设计
Table1 Designing of theexperiment
| Ⅰ | 对照，灭菌育苗基质 清水浸根 |
| Ⅱ | 对照，灭菌育苗基质 青枯病原菌灌根 |
| Ⅲ | 对照，灭菌育苗基质 生防EGB菌灌根 |
| Ⅳ | 灭菌育苗基质 青枯病原菌 EGB菌灌根（混合接种） |
| V | 灭菌育苗基质 先加青枯病原菌 后加BS菌灌根（间接）
|
| VI | 灭菌育苗基质 青枯病原菌 农用链霉素灌根 |
注：实验共设6个处理，每个处理3盆。
2)待供试烟草植株生长至5或6片叶龄期时进行移栽，移栽前，使用上述灭菌处理的育苗基质经湿热灭菌，分装到盆（直径8cm)里，每盆装0.5kg，喷洒少量的水并搅拌，让基质稍微湿润，使基质含水量大约40％。
3)采用伤根浇菌液接种法（土壤灌根接种法）进行各处理的接种试验,在植株距茎1cm的地方用手术刀向下划3-4厘米长、4厘米深的口子，青枯菌按照每克土1×106CFU，BS菌悬液10mL,将制备的菌悬液灌根接种到相应处理的盆钵中。期间间隔一周喷洒营养液及清水，持续2到3次利于植株发病，出现发病植株后观察记录发病的株数，植株可见明显青枯症状即记为发病株。
烟草移栽后45天，小心地将每个处理的3株烟苗整株挖出，洗去根部泥土，分别测定地下部和地上部的鲜重、株高、最大叶和叶宽等指标，具体参照《烟草农艺性状调查方法》(YC/T142-1998)。
烟草苗成活后定期观察烟苗的生长状况，从第一株植株出现病症开始，定时统计发病状况，到处理组发病率达到80结束本季盆栽实验。发病等级判定依据如下
0级：无发病植株；
1级：茎部有黑色条斑或退色绿斑，或1/5以下叶片萎焉；
2级：茎部黑色条斑增多变长，但未至植株顶部，或1/5-1/3上叶片萎焉；
3级：茎部黑色条斑到达烟株顶部，或发病1/3-2/3叶片萎焉；
1）生物有机肥制备：将灭菌后的兔粪研磨成粉末，与稻及以2：1（质量比）混合，分装在培养皿中，湿热灭菌2-3次。将BS菌培养液以1的接种量接入上述有机肥中，调节温度为 30-45 ℃，含水量为75 ，发酵4-5天，期间不断翻抛。
2）田间试验设计：设置10个试验小区，每个小区代表一个试验处理，面积为86.4m2（6m×14.4m）。每个小区包括5垄，每垄32株烟草苗，小区之间设置1垄隔离行，正常种植烟草，垄距1.2m，株距0.45m。稀植烟苗的株距为0.60m，每垄烟苗为24株。烟草移栽时间为2019年3月25日，第二次菌剂处理时间为2019年5月19日。各处理编号和菌剂施用情况如下：
表2 试验设计
Table2 Designing of theexperiment
| CK | 对照处理，常规种植，常规密度，不施菌肥 |
| BS2 | 每株烟苗移栽时施2ml菌剂 |
| BS5 | 每株烟苗移栽时施5ml菌剂 |
| BS2 2 | 每株烟苗移栽时施2ml菌剂，第二次施2ml菌剂 |
| BS5 5 | 每株烟苗移栽时施5ml菌剂，第二次施5ml菌剂 |
| BS0 5 | 移栽时不施菌剂，每株烟苗第二次施5ml菌剂 |
| 稀植处理 | 株距为0.60m，不施菌剂 |
| 深沟处理 | 垄高由原来0.45m增加到0.70m |
| 菌肥处理 | 每株烟苗第二次根部穴施10g菌肥 |
4. 研究创新点
不同于以往采用化学防治或抗性品种培育防治烟草青枯病的方法，本实验采用粘细菌BS对烟草青枯病的防治效果进行研究。
5. 研究计划与进展
| 时间 | 实验内容 |
| 2018/12-2019/1 | 实验设计、文献查阅、烟草育苗 |
| 2019/1/1-2019/1/15 | 菌株活化、烟草植株移栽 |
| 2019/1/15-2019/2/1 | 温室青枯病抗病性试验实施 |
| 2019/2/15-2019/3/15 | BS菌对青枯菌的捕食能力评估实验、烟草移栽于大田试验 |
| 2019/3/15-2019/4/10 | 植物学性状及生物量的测定、烟草发病等级判定 |
| 2019/4/10-2019/5 | 整理实验数据、撰写毕业论文 |
