1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题研究意义：
细胞自噬作为真核细胞保守的分解代谢过程，对维持细胞稳态和生理平衡，以及各种疾病的引发和治疗发挥着极其重要的作用。pi3k是一类关键的胞内信号调控分子,可形成复合体i和复合体ii，分别参与细胞自噬和vps路径。而目前，对于复合体i亚基atg38，复合体ii亚基vps38的研究甚少。本课题旨在探讨pi3k复合体亚基vps38和atg38是否协同影响细胞自噬，为自噬机制的研究和人类疾病的治疗提供新思路。
国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
据研究，作为pi3k复合体亚基，atg38缺失的酵母细胞自噬活性显著降低，而vps38缺失突变体中饥饿诱导的自噬也受到抑制。本课题拟构建vps38和atg38双基因缺失突变体，对比其与单缺失突变体自噬缺陷程度的差异，分析vps38和atg38是否协同影响细胞自噬。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
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酵母菌株和生长条件
本研究中使用的菌株来自SEY6210。酵母菌株在26℃下在YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)中进行培养；使用SD（-N）培养基（0.17％不含氨基酸的酵母氮碱和添加2％葡萄糖的硫酸铵）进行氮饥饿。
2 Western blot检测Atg8以及降解的Atg8的量
部分Atg8位于自噬体的内膜，随自噬体一同进入液泡降解，通过对比降解的Atg8的量便可知道形成的自噬体的量，进而知道细胞自噬发生水平的高低。这种方法一般是在Atg8的N端连上标签蛋白，如绿色荧光蛋白GFP；当自噬体与液泡融合后，其内含物被释放进液泡被水解酶降解，包括GFP-Atg8；由于GFP结构域的稳定性比较高，会单独存在一段时间，因而可以通过Western blot检测GFP的条带来衡量降解的GFP-Atg8的量，间接检测细胞自噬发生水平的高低。此外，用荧光蛋白做标签，也可以通过荧光显微镜观察Atg8是否进入液泡来判断自噬是否发生。
3 通过GFP-Atg8 单荧光自噬指示体系
利用Atg8在自噬形成过程中发生聚集的原理的GFP-Atg8指示技术：无自噬时，GFP-Atg8 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成过程中，GFP-Atg8融合蛋白转位至自噬体膜，随着自噬的进行，闭合的自噬体会与液泡融合进入液泡降解。
实验方案：
1 基因敲除突变菌株的构建
设计引物（Atg38::Hyg-For Atg38::Hyg-Rev）；PCR扩增替换片段；运用LiCl对SEY6210 GFP-Atg8 和SEY6210 GFP-Atg8 Vps38::KanMX 菌株进行ATG38基因敲除；Hyg平板筛选敲除成功菌株；提取其基因组DNA，进行诊断PCR进一步鉴定。最终获得atg38和atg38 vps38菌株。
2 SD-N氮饥饿培养（2/4h）
3 突变菌株自噬程度的观察
运用荧光显微镜通过GFP-Atg8观察比较atg38 vps38双突变株与atg38和vps38单突变株的表型差异，并运用Western Blot比较Atg8含量及降解的Atg8的量，分析自噬水平的差异。
技术路线：
可行性分析：
通过前期文献阅读，作者已对酵母自噬的机理及待研究的PI3K复合体亚基Vps38和Atg38的作用有了初步理解；本项目指导教师专注于研究酵母自噬，积累了丰富的实验经验，取得一系列研究进展；所在实验室相关研究技术成熟，设备齐全。以上皆为本项目的开展奠定理论与实践基础。
本课题工作量难度适中，实验步骤详尽可行，可在预计时间内完成。
4. 研究创新点
本课题创新之处在于首次探讨PI3K复合体亚基Vps38和Atg38是否协同影响细胞自噬，为自噬机制的研究提供新思路及应用价值。
5. 研究计划与进展
2018年10月-2019年1月
查阅文献。构建atg38 vps38菌株并验证。
2019年2月-4月
