1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 1．沙雷氏菌简介 本实验的实验材料是沙雷氏菌。沙雷氏菌（Serratia sp.）又称灵杆菌，是一种广泛分布于水和土壤等环境及食物中的兼性厌氧菌，能产生非水溶性色素的革兰氏阴性细菌。一般存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。粘质沙雷氏菌能分泌红色灵菌红素，灵菌红素具有多种生物活性，例如抗癌，抗霉，免疫抑制等。 2．酰基转移酶简介 酰基转移酶（acyltransferase）是一个多功能蛋白质大家族。不同的酰基转移酶在生物体的遗传、基因表达、物质代谢、信号传导等方面起着重要的作用。人们也在对其作用或与之相关的功能作进一步研究。 酰基转移酶的主要基础功能是催化蛋白质的酰基化和去酰基化，而酰基化和去酰基化又是真核生物蛋白质翻译后修饰中最普遍的方式，所以酰基转移酶也有调节蛋白质生物活性、基因表达等多种更复杂的生理功能。 3. N-乙酰基转移酶 本课题研究的酰基转移酶（L085_22690）属于N-乙酰基转移酶。 N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT)是一个二相代谢酶，能催化乙酰基团从乙酰CoA 转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上。NAT酶主要催化芳香胺和肼的乙酰辅酶A依赖的N-乙酰化（通常失活）或其N-羟基化代谢物的O-乙酰化（通常活化）。在已经研究的所有NAT中，反应机制是通过乙酰化的半胱氨酸中间体，半胱氨酸通过具有组氨酸和天冬氨酸的催化三联体被激活。 在细菌中，N-乙酰转移酶能影响细菌的毒力。N-乙酰转移酶能以调控双组份系统的方式影响细菌的毒力。双组分系统（TCSs,Two-ComponentSystems）是细菌最重要的信息传递系统，它能将细菌外部的不利环境条件，翻译成化学信号并传递至胞内，使细菌能及时调整自身状态以适应恶劣的生存环境[1]。 PhoP-PhoQ是一个存在于多种细菌中的双组分系统，这一双组分系统的活性受乙酰转移酶乙酰化的调控，进而影响着某些细菌的毒力作用。 以沙门氏菌为例，PhoP-PhoQ可以调节沙门氏菌对Mg2 及其他周质环境的适应性，进而调控毒力基因的转录和表达，在沙门氏菌毒力调控中发挥重要作用[2]。PhoP和PhoQ是许多基因表达所必需的蛋白，具有PhoP / PhoQ突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株易于抵抗先天免疫杀伤。沙门氏菌PhoP/ PhoQ调节剂通过感知宿主环境以促进细菌包膜的重塑，这种重塑包括修饰脂多糖（LPS）的酶。修饰的LPS通过增加对阳离子抗微生物肽的抗性和改变宿主的LPS识别来促进细菌存活[3]。 细菌的耐药性也与N-乙酰基转移酶的活性有关。近来研究发现，细菌可以产生包括N-乙酰基转移酶在内的多种修饰酶。这些修饰酶能共价修饰氨基糖苷类抗生素特定的氨基或者羟基基团，干扰抗生素与核糖体的结合，从而使细菌对抗生素产生耐药性。
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| 这是细菌产生严重的耐药现象的原因之一。 例如近期发现，沙门氏菌通过赖氨酸乙酰化的修饰调节，产生对于环丙沙星类药物的的抗药性，其抗药性产生与赖氨酸乙酰化的修饰频率间的关系得到充分证明[4] 。 在人体中，芳香胺及杂环胺类物质通过人体的代谢转化后会产生包括致癌作用在内的多种毒性，NAT也在多种药物的代谢途径中起到重要作用。早期研究发现,NAT催化乙酰基从乙酰CoA上转移到异烟肼的氮原子上后使之失活,而异烟肼的失活率在不同人群和个体之间存在很大的差异。后来的研究则表明不同个体对叶酸、磺胺类等药物的乙酰化能力都存在很大差异[5]。 这也使得在预测药物的毒副作用时，需要考虑个体基因型不同带来的差异。目前的主流观点是，大部分药物代谢与NAT1和NAT2这对同工酶的多态性有关[6]。 在药物方面。异烟肼，磺胺二甲嘧啶，氨苯砜，2-氨基芴和4-氨基联苯等主要被NAT2乙酰化，而对氨基水杨酸（PAS）、对氨基苯甲酸（PABA）和磺胺、叶酸等则被NAT1乙酰化[7]。NAT催化完成的乙酰化作用是该类物质代谢转化的重要步骤之一。发生在氮原子上的乙酰化作用所产生的胺类衍生物通常是无毒性的，而发生在氧原子上的乙酰化作用所产生的乙酰氧基芳胺类(或杂环胺类)衍生物中含有高反应活性的氮离子，极易与DNA结合形成DNA复合物，引起DNA突变，从而导致细胞癌变。与此同时，肿瘤组织中普遍能检测到高表达的NAT酶，因而是一个潜在的肿瘤标志物和调控靶点。不仅如此，NAT1基因多态性与癌症易感性相关性较低，而NAT2基因多态性与癌症易感性关联性较高。对于其N-乙酰化是解毒步骤（如芳香胺依赖的膀胱癌）的癌症，NAT2缓慢的乙酰化表型具有更高的风险。相反，对于其中 N-乙酰化可忽略不计的癌症和O-乙酰化代谢是活化步骤的癌症，例如杂环胺相关的结肠癌，NAT2快速乙酰化表型具有更高的风险[8]。 N-乙酰基转移酶对人体对蛋白底物的乙酰化也十分重要，Ac-CoA被作为人类中的Naa催化亚基（hNaa10p）活性的调节因子，研究表明调节NAT活性确实可以产生特定的生物学目的。研究发现抗凋亡因子Bcl-xL通过抑制Ac-CoA的产生，部分介导其作用。而较低水平的Ac-CoA导致Naa10介导的细胞凋亡介质caspase（胱天蛋白酶）2,3和9，还有Bax（一种细胞凋亡因子）的N末端乙酰化减少，导致细胞凋亡减少[9]。 应用前景： 酰基转移酶在多种重要的生物学活动中起到主要调控作用。相信在将来,酰基转移酶的酰基化作用在生命现象中的重要性也必将更为人们所重视。 本实验采用分子生物学技术，将沙雷氏菌(Serratia sp.)FS14中乙酰基转移酶（L085_22690）的目的基因用PCR技术扩增，将目的片段酶连进表达载体，转入粘质沙雷氏菌FS14中进行表达，将表达产物进行分纯化。获得有活性的目的蛋白，为乙酰基转移酶的结构和功能研究奠定基础。
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| 参考文献： [1] 陈嘉瑜, 蔡霞, 瞿涤. 沙门菌PhoP-PhoQ双组分信号转导系统[J]. 微生物与感染, 2010, 05 [2] R.K. Ernst, T. Guina, S.I. MillerSalmonella Typhimurium outer membrane remodeling role in resistance to hostinnate immunity Microbes Infect., 3(14-15) (2001), pp. 1327-1334 [3] 郑卫. 氨基糖苷类抗生素研究的新进展[J]. 国外医药抗生素分册, 2005, 26(3)178-179. [4] Lin Li, Wenjing Wang,Ruiliang Zhang, First acetyl-proteome proling of Salmonella Typhimuriumrevealed involvement of lysine acetylation in drug resistance Veterinary Microbiology, Volume 226,November 2018, Pages 1-8 [5] 冷伟卫等. 中国药理学通报, 2005, 21(11) 1296-1299. [6]邬宇美,骆子义.N-乙酰基转移酶2基因多态性研究进展[J].医学综述,2010,16(07)972-975. [7] C.Bruhn,J.Brockmoller, I.Cascbi,I.Roots, H.H.Bchert Crelation between genotype phenotype ofthe humanary lamine N-acetyltransferase type 1(NAT1) Biochem.Pharmacol.58(11)(1999),pp.1759-1764 [8] D.W. Hein Molecular geneticsfunction of NAT1 NAT2 role in aromatic amine metabolismcarcinogenesis Mutat.Res.,506–507(2002), pp.65-77 [9]陈瑛毅,徐宏俊.N-乙酰转移酶2与皮肤疾病相关研究进展[J].中国误诊学杂志,2011,11(06)1274-1275.
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2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
将沙雷氏菌中的一个酰基转移酶（l085_22690）表达纯化。
3. 研究的方法与方案
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4. 研究创新点
本实验对象选取一个沙雷氏菌里的酰基转移酶，通过筛选，得到含有该酰基转移酶的菌株，研究其在本体中的过表达情况，获得目的蛋白，为乙酰基转移酶的结构和功能研究奠定基础。
在技术研究上，涉及微生物学、分子生物学等学科知识，体现了交叉学科研究特点。
5. 研究计划与进展
2018年10月-2018年12月，查阅资料、文献；学习和熟悉基本实验操作。
2019年1月-2019年3月，酰基转移酶（l085_22690）基因的过表达。
2019年3月-2019年4月，对酰基转移酶的分离纯化。
