植物根际促生菌在调控多花黑麦草对镉胁迫的响应中的作用开题报告

对可能出现的结果进行综合分析，探究施加根际菌后黑麦草体内镉的转运分布积累规律

研究方法

1.实验材料：

（1）植物材料：一年生黑麦草牧谣

（2）根际促生菌：Pi01、Ls01、Ma02

2.实验方案：

2.1试验材料的培养

选取饱满的一年生黑麦草种子，用10% H₂O₂对种子表面进行消毒处理，15 min后，用去离子水清洗三遍。漂浮法进行种子萌发，六天后，选取生长一致的幼苗移栽至1L塑料杯中进行营养液培养(1/4 Hoagland营养液，pH 6.5)，每三天更换一次培养液，期间使用菌悬液浸根一次。

2.2处理组设置

待幼苗长至三叶一心左右进行镉（20 μmL^-1， CdCl₂ 2.5H₂O）处理，以施加无菌水作对照，分别设置如下组：CK、Pi01、Ls01、Ma02、CK Cd、Pi01 Cd、Pi01 Cd、Ma02 Cd，共八组，每组设四个重复。

2.3指标测定

2.3.1测定黑麦草植株鲜重、干重

2.3.2计算含水量

2.3.3测定叶绿素含量

（1）分别取不同处理新鲜植物叶片,擦干净表面,剪去叶中脉,只取叶片2 g。

（2）放入研钵中,加少量石英砂及2-3 mL95%乙醇研成匀浆,再加10 mL95%乙醇,研磨至组织变白，静置。

（3）取滤纸一张,置于漏斗中,用95%乙醇湿润,沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中,过滤到5 mL棕色容量瓶中,用少量95%乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。

（4）用滴管吸取95%乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中,直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至25 mL,摇匀。

（5）把叶绿体色素提取液倒入1 cm的比色杯中。以95%乙醇为空白,在波长665 nm（叶绿素a）、649 nm（叶绿素b）、470 nm（类胡萝卜素）下测定吸光度。

2.3.4测定脯氨酸含量

（1）分别取不同处理的剪碎混匀新鲜叶片0.2~0.5 g,分别置于大试管中,加入5 ml 3%硝基水杨酸溶液,管口加盖玻璃球,于沸水浴中浸提10 min。

（2）冷却后进行过滤，滤液转入到离心管中。

（3）用移液枪吸取2 mL提取液转移到另一个离心管中，接着加入冰醋酸和酸性茚三酮试剂各2 mL，沸水浴中加热30 min。

（5）吸取上层的红色甲苯溶液，以甲苯为空白对照，用720型分光光度计在520 nm波长处，测定吸光度值。

2.3.5测定丙二醛含量

（1）取不同处理新鲜植株的叶和根，去离子水冲洗干净后用滤纸吸干。分别称取0.3 g，加5% TCA 5 mL于研钵中，将研磨后的匀浆在3000 rmin-1下离心10 min。

（2）取上清2 mL，加0.67% TBA 2 mL，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后再次离心。在450 nm、532 nm、600 nm处测定上清的吸光值。

2.3.6测定SOD含量

（1）分别称取不同处理植物材料0.5g于预冷研钵中,加2 ml预冷的提取介质在冰浴中研磨匀浆,转至10 ml 容量瓶中,用提取介质冲洗研钵2~3次,合并冲洗液于容量瓶,定容至10ml。

（2）取5ml提取液于4℃1000 r/min(10 000g)冷冻离心15 min,上清液即为SOD酶粗提液。

（3）取透明度好,质地相同的试管7支,测定管和光下对照管各3支,暗中对照1支,加入显色试剂。

（4）暗中对照管用双层黑色纸套遮光,全部试管在荧光灯下显色,反应15~20 min 。反应后用黑布遮盖试管终止实验,以暗中对照管作空白,在560 mm 下测定1~6号试管反应液的光密度,记录测定数据。

2.3.7测定H₂O₂含量

(1)称取不同处理新鲜植物组织2 g,按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。

(2)用移液管吸取样品提取液1 ml,按表1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后5000 rpm/min离心10 min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。

(3)向洗涤后的沉淀中加入2 mol/L 硫酸5 ml,待完全溶解后, 在415 nm波长下比色测定。

2.3.8测定Cd含量

（1）将消煮管用去离子水清洗干净，再用10%的HNO₃溶液浸泡24 h，清水冲洗干净后用去离子水润洗，置于烘箱内烘干备用。

（2）分别取烘干至恒重不同处理的植物样本0.1 g，加入8 ml HNO₃-HClO₄(V:V=85:15)的混合液浸泡植物样品，进行冷消煮12 h，再用消煮炉消煮至干，用2.5%的HNO₃溶液定容10 mL，70℃水浴溶解30 min后，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定植株的镉离子浓度。

（1）分别称取分别称取不同处理植物材料0.2 g样品置于研钵中,加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后,定容至6 ml, 8000转离心10 min。收集上清液,测量提取液体积。

（2）取上清液2 ml,显色，测定显色液在412 nm处的吸光度。

2.3.10根系分析与根系活力的测定

用EPSON扫描仪扫描根系，WinRHIZO软件分析根系，得根系形态和根系构型数据。

可行性分析

1.预期结果：

（1）通过前期耐镉根际促生菌的筛选，初步确定了根际菌能够促进黑麦草生长。

（2）水培条件下，设置CK、CK Cd、菌、菌 Cd。加镉抑制植株生长，添加根际菌之后促进植物生长；加镉处理后，添加根际菌仍能促进植物生长。

2.注意事项：

（1）挑选幼苗长势应一致