1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题研究意义及应用前景
甲烷（ch4）作为一种信号分子，被证实能够提高内源no水平[1]，一氧化氮(nitricoxide，no)是第一个被发现的参与体内信号转导的气体信号分子，no功能多样，调控方式可能是多靶点、多机制同时作用的网络调控。
亚硝基化(s-nitrosylation)是近年来新发现的一种不依赖于环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cgmp)的no信号传导途径, 即no可逆地共价结合到蛋白质半胱氨酸巯基(cys-sh)上形成亚硝基硫醇(rcys-sno)的过程。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标及内容
（1）通过切片检测验证不同处理下不定根原基的发生情况
（2）提取纯化总蛋白和亚硝基化蛋白，定量检测蛋白含量
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法
1.1 实验材料
露丰黄瓜种子
1.2实验步骤
1.2.1植物材料准备
培苗：黄瓜种子使用5% 次氯酸钠消毒15 min后洗净，置于28 ℃培养箱中避光培养2天，挑选长势均一的种子光照培养5天，至叶片完全展开，根系生长良好。
去除植株中生长素：切除植株顶芽，置于10 μM萘基邻氨甲酰苯甲酸（NPA）中处理2天，耗尽植株中的生长素。
外植体制备：将处理后的植株切去初生根，用于接下来的处理。
1.2.2不同组合处理
预实验分为Non-depleted、Con、CH4、CH4 PTIO、CH4 SNP、PTIO、SNP七种处理，PTIO浓度和SNP浓度均为10 μM，后续实验增加浓度梯度。
1.2.3不定根原基切片检测
分别取不同处理的植株，使用甲苯胺蓝染色法，在显微镜下观察原基生长情况。
1.2.4蛋白质提取纯化
（1）称取0.2 g样品，液氮研磨，加入1.2 ml甲醇（提前加蛋白酶抑制剂PMSF1：100）
（2）置于-20 ℃中10 min，期间不断颠倒混匀（约3-4次）
（3）16000 r，4 ℃离心5 min，弃上清
（4）重复1-3步，直到颜色变乳白（约4-5次）
（5）加1.2 ml丙酮（-20℃预冷），涡旋，-20 ℃放置5 min
（6）16000 r，4 ℃离心5 min，弃上清
（7）重复5-6步，重复1-2次
（8）吹干至粉末（约30 min）
（9）加600 μl Type4溶解
1.2.5蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法、Saville-Griess法）
总蛋白含量使用考马斯亮蓝法测定
亚硝基化蛋白含量使用Saville-Griess法测定
测定总蛋白含量：考马斯亮蓝法
（1）原理：考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1000 μg/mL，最小可测2.5 μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
（2）试剂
考马斯亮蓝G－250染色液（1L）：称取0.1 g考马斯亮蓝G－250溶解于50 ml 95％的乙醇中，加入100 ml 85％的磷酸。
标准蛋白质溶液：牛血清蛋白(BSA)，准确称取0.1 g牛血清白蛋白，用100 ml 0.05M Tris-HCL缓冲液稀释，制成1mg/ml的标准蛋白质溶液，校准BSA浓度1mg/ml的A280为0.66。
需要250 ml 0.05M Tris-HCL缓冲液（PH8.0）（250ml）：称取1.514 g tris碱，加入200 ml蒸馏水溶解，用盐酸调节PH至8，定容至250 ml
提取缓冲液：称取1.316 g Nacl，溶于150 ml Tris-HCL缓冲液中
（3）操作步骤
标准曲线绘制
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| BSA体积（μl） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| TRIS缓冲液体积（μl） | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
| BSA含量（μg） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 每只试管加入3ml考马斯亮蓝，混匀静置5min，与595nm测定吸光度 | ||||||
| A595 |
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测定时用95%乙醇清洗比色皿
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标轴上绘制标准曲线。
样品中蛋白质含量测定
蛋白质含量测定：取0.1 ml上清，加入考马斯亮蓝3 ml，混匀静置5 min，于595 nm测定吸光度，根据标准曲线确定蛋白含量
样品的蛋白含量（μg/g）=m（μg）×提取液总体积/（所取提取液体积×样品鲜重）记录称取样品重量
测定S-亚硝基化蛋白含量：Saville-Griess法
（1）实验原理：SNO含量用Saville-Griess法检测：SNO被FeCl2破坏，释放的NO与对氨基苯磺酸反应，生成的重氮盐与芳香胺（N-(1-萘基)-乙二胺）结合生成偶氮染料，可以被540nm波长测定。
（2）试剂
100 μg/ml亚硝酸钠溶液:称取0.01g亚硝酸钠，稀释至100 ml。
1%对氨基苯磺酸溶液：1g对氨基苯磺酸溶于100ml蒸馏水
0.3% 盐酸萘乙二胺：称取0.3g盐酸萘乙二胺，蒸馏水定容至100ml，震荡摇匀，确保完全溶解
3.75mMFeCl2溶液：称取0.02gFeCl2溶于20ml蒸馏水中
（3）实验步骤
标准曲线制备：配置0.5ml标准浓度的亚硝酸钠溶液0-5 μg，加入HCL，1 ml 1%对氨基苯磺酸溶液，1 ml 0.3% N－萘乙二胺，100μl 3.75mM FeCl2室温保持30min后测定540nm处的光密度值，将此值与亚硝酸盐浓度进行直线回归，求回归方程和R值。
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 亚硝酸钠（100μg/ml）（μL） | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| 蒸馏水（μL） | 500 | 490 | 480 | 470 | 460 | 450 |
| 亚硝酸钠含量（μg） | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 加入1ml1%对氨基苯磺酸溶液，1 mL 0.3%盐酸萘乙二胺，100μl 3.75mM FeCl2反应30min | ||||||
| A540 |
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取0.5mL上清加入1 ml的1%对氨基苯磺酸和1 ml 0.3%盐酸萘乙二胺中，加入100μl 3.75mM Fecl2，冰浴黑暗条件下处理20min。不含FeCl2为对照。
SNO含量通过测定540nm处吸光度获得。然后在上述直线方程中获得SNO测定值。
2. 技术路线
3.可行性分析
本研究以陆丰黄瓜为材料，使用相关试剂处理，切片验证其对不定根生长的影响，通过蛋白提取纯化及蛋白定量检测等方法开展实验。实验室中上述材料及所涉及的相关试剂都较为齐全，已有的研究证实了此方法可靠，相关的仪器设备也较为完备。并且，课题选题恰当，难度适中，工作量适中，且能够取得较为明显直接的结果。
4. 研究创新点
选取与不定根中的蛋白，测定其亚硝基化水平，为下一步筛选出某种特定蛋白研究它们可能的酶、蛋白活性、稳定性打下基础，之后的研究可以检测特定蛋白的亚硝基化位点，研究不同位点亚硝基化对蛋白的影响。
5. 研究计划与进展
2019年3月：不定根原基数据完成、蛋白质分离纯化测定预实验
2019年4月：蛋白质定量测定
2019年4月-2019年5月：整理实验结果并撰写论文
