TYLCV基因组潜在ORF的鉴定与功能验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus, tylcv）属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，能够侵染番茄、烟草等经济作物，每年对世界范围内的茄科作物生产造成巨大的损失^[1]。tylcv基因组为一条单链环状dna（ssdna），全长2.7 kb，在其正义链上目前已经鉴定到2个开放阅读框（open reading frame, orf），分别编码一个cp蛋白和v2蛋白；其互补链上鉴定到4个orf，分别编码一个rep蛋白、c2蛋白、c3蛋白和c4蛋白。这些多功能蛋白在tylcv自身复制和侵染破坏植物免疫系统的过程中起到重要的作用^[2]。

通过先期对tylcv基因组序列和起始密码子分析，发现tylcv基因组中潜在的orf（核苷酸数大于30）有43个，目前已经发现的6个开放阅读框在25种tylcv中高度保守，且编码蛋白分子量大于10 kd。其余的orf不都存在于这25种tylcv中，呈现出一定的进化关系。目前对植物病毒蛋白的研究聚焦于分子量大于10 kd的蛋白，对于基因组中编码产物低于10 kd的orf研究较少，但也发现了一些例子。在马铃薯x病毒（potato virus x，pvx）基因组上，orf 4编码一个8k蛋白，8k蛋白包含在一个三基因区中，能够参与病毒的细胞间移动，并且具有一定的种间特异性^[3]。在马铃薯帚顶病毒（potato mop-top virus，pmtv）rna 3中，有一个编码8k大小的富半胱氨酸蛋白，在pmtv侵染植物过程中起到寄主rna沉默抑制子的作用^[4]。tylcv隶属于双生病毒科，目前在双生病毒中也发现了小于10 kd的orf。在印度绿豆黄花叶病毒（mungbean yellow mosaic india virus, mvmiv）基因组互补链上存在一个编码产物小于10 kd的orf编码ac5蛋白，该蛋白能够抑制寄主的转录基因沉默和转录后基因沉默，并且能够激发寄主的过敏反应^[5]。目前，在tylcv中还没有类似的报道，另外，是否还存在其他更多的orf编码小于10kd的功能蛋白还有待进一步的验证。

对tylcv基因组中的潜在orf进行鉴定和功能验证，有助于丰富我们对于病毒基因组编码策略与表达的认识，为更加深入的解析tylcv的致病机制提供一个新的视角，同时，也有助于我们认识tylcv的田间进化过程与特性。未来，这些小蛋白作为致病蛋白可以用来作为植物抗病育种的新靶标，也可以成为探索植物免疫系统未知调控原件的探针。并且，对tylcv这种双生病毒模式种的研究也为探究其他病毒潜在orf功能提供了新的参考。

2. 研究的基本内容和问题

一. 研究目标：

我们将对tylcv基因组中的五个潜在的orf进行鉴定与功能的初步验证，了解这些潜在orf的生物学功能以及其在进化上的意义。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法：

1. 分子克隆操作技术

利用pcr体外扩增及数从tylcv模板上克隆目的片段，利用topo连接反应体系以及bp同源重组反应体系将目标片段连接至初始载体上，构建质粒转化大肠杆菌dh-5α。之后提取质粒，利用gateway反应（lr同源重组反应）体系将片段连接到gfp融合表达载体上，并转化大肠杆菌dh-5α，提取质粒测序验证。验证结果正确就转化根癌农杆菌gv3101，制备菌液以备拟南芥转化与本氏烟瞬时表达。

4. 研究创新点

TYLCV是一种对农业生产造成巨大破坏的植物病毒，目前对于其基因组中具有ATG起始密码子与终止密码子的潜在ORF（编码产物小于10kD）的研究依然是空白，本实验将对这些潜在ORF的鉴定与功能验证，这将有助于我们深入理解TYLCV的致病机制与进化过程，并为其他植物病毒类似ORF框的发掘提供参考。具有一定的创新性。

5. 研究计划与进展