1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
（一）本课题的意义
苞卫是于2009年被巴斯夫（德国）有限公司推出的一种苯甲酯吡唑酮类除草剂[1]。该药具有除草效率高、对玉米生长安全的特点，对耐草甘膦（氨基酸类），三嗪类，磺酰脲类、咪唑啉酮类、芳氧苯氧丙酸类除草剂的杂草有很好的防除效果，能够有效防除玉米田中一年生禾本科和阔叶杂草。相比于草甘膦等非选择性除草剂，该除草剂对作物具有一定的针对性，且生产性能优良，对人类比较安全，从而在农业上应用广泛[2]。
在生物体的l-酪氨酸分解代谢中，首先由酪氨酸氨基转移酶将酪氨酸转化成对羟苯基丙酮酸(hpp)，对羟苯基丙酮酸双加氧酶（p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, hppd）催化 hpp与o2形成尿黑酸 (hmg)；尿黑酸经过一系列酶的作用最终形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解。在植物和光合细菌中，hppd除了参与酪氨酸分解代谢外，还是植物体中质体醌和生育酚生物合成途径的关键酶。以苞卫为代表的新型除草剂的作用靶标是hppd[3]：苞卫能够抑制hppd的活性，作为类胡萝卜素生物合成途径中最终电子受体和光合链电子传递体的质体醌的生物合成受阻，进而抑制植物体内类胡萝卜素的合成，干扰叶绿体的合成和功能，使叶绿素氧化降解，发芽的敏感杂草出现白化症状[4]。
2. 研究的基本内容和问题
（一）研究的目标
筛选获得苞卫高抗性菌株，并对其进行分类鉴定，以及对其抗性基因hppd做进一步的研究。
（二）研究的内容
3. 研究的方法与方案
（一）研究方法
1.苞卫抗性菌株的分离纯化
使用以酪氨酸为唯一碳源的无机盐培养基（TMSM）培养能利用酪氨酸的菌株；通过逐步提高培养基中苞卫的浓度（500、700、1000、1500、2000 mg/L），筛选出能够在不同高浓度苞卫环境下生长的菌株；取培养液涂布于含有高浓度苞卫的固体TMSM培养基上，挑取菌落形态不同且长势较好的单菌落反复划线纯化从而得到单一的菌株。
2.抗性菌株的16S rRNA基因序列分析以及系统发育地位的确定
根据 16S rRNA 基因的测序结果，采用生物信息学的手段进行分析并构建抗性菌株的系统进化树。
3.苞卫抗性基因 hppd 的进一步研究
在生物信息学比对的基础上，寻找抗性基因 hppd，并对其进行进一步的研究。
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*：在L-酪氨酸分解代谢中，有两条分解代谢途径，其一是L-酪氨酸在酪氨酸脱羧酶的作用下脱羧基生成酪胺，进而在单胺氧化酶的作用下分解成NH3、H2O和CO2；另一条代谢途径是由酪氨酸氨基转移酶将酪氨酸转化成对羟苯基丙酮酸(HPP)，然后在第二步反应中，HPPD催化 HPP与O2形成尿黑酸 (HMG)；尿黑酸经过一系列酶的作用最终形成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解。因本实验要得到含有苞卫HPPD靶标酶的菌株，所以要舍弃不经过HPPD催化途径的节杆菌。
（三）实验方案
1.实验材料
（1）培养基
酪氨酸基础无机盐培养基（TMSM）： NH4NO3 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，NaCl 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，酪氨酸 1 g，去离子水 1 L ，pH 7.0。
苞卫酪氨酸基础无机盐培养基：在 TMSM 中加入过滤除菌的苞卫母液，以配置成不同浓度苞卫的 TMSM。
（2）实验仪器
UV-2401 紫外可见分光光度计、PCR 扩增仪、核酸电泳仪、Tanon 2500 凝胶成像系统以及微生物学实验室其他常规仪器。
2.实验方法
（1）苞卫抗性菌株的分离纯化
称采集的土样 5 g 加入 100 mL 的去离子水中，在30℃、150 r/min的摇床中振荡 2 h 后取出静置 5 min，取 5 mL 悬浮液加入到100 mL 500 mg/L 苞卫的 TMSM 中，30℃、150 r/min 培养 72 h。取上述培养液 5 mL 加入到100 mL 700 mg/L 苞卫的 TMSM 中，30℃、 150 r/min 培养 72 h。以此类推，将前一轮培养液逐级加入 1000、1500、2000 mg/L 苞卫的 TMSM 中 30℃、150 r/min 培养 72 h。同时取适量培养液稀释涂布于含有2000 mg/L苞卫的固体TMSM 培养基上，挑取菌落形态不同的单菌落反复划线纯化。
（2）抗性菌株的 16S rRNA 基因序列的扩增
参照细菌基因组 DNA 提取方法提取菌株基因组 DNA：
1) 细菌培养：细菌接种于5 mL液体TMSM中，37 ℃摇床（300 rpm）培养过液。
2) 细菌收集：取1 mL培养物于1.5 mL EP管中，室温8000 rpm离心5 min，弃上清，沉淀重新悬浮于1 mL ddH2O（pH8.0）中。
3) 菌体裂解：加入6 μL 50 mg/mL的溶菌酶，37 ℃作用2 h；再加2 mol/L NaCl 50 μL，10 SDS 110 μL，20 mg/mL的蛋白酶K 3 μL，50 ℃作用3 h或37 ℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）
4) 抽提：菌液均分到两个1.5 mL EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10 min。12000 rpm离心10 min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）
5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min。12000 rpm离心10 min。
6)洗涤：沉淀用75的乙醇洗涤。
7) 抽（凉）干后，溶于50 μL ddH2O中，取2-5 μL电泳。
采用细菌通用引物进行16S rRNA 基因的 PCR 扩增。通用引物序列为： 上游引物 Primers F：5′-TGGCGAACGGGTGAGTAATACAT-3′；下游引物 Primers R：5′-GCGGTTAGGCTAACTACTTCTGG-3′。
PCR 扩增体系如下：
| 试剂 | 用量（L） |
| Primers F | 1 |
| Primers R | 1 |
| 2×Taq Master Mix | 25 |
| DNA 模板 | 1 |
| dd H2O | 22 |
PCR 扩增程序如下：
| 温度（℃） | 时间 |
| 95 | 5 min |
| 95 |
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| 58 | 20 s 30cycles |
| 72 | 1 min 30 s |
| 72 | 5 min |
| 4 | 5 min |
（2）抗性菌株系统发育地位的确定
根据 16S基因的测序结果，在 http//www.ncbi.nlm.nih.gov 在线查询分析，利用 BLAST 软件在 GenBank 中与其他的 16S基因序列进行同源性比较，选取与其同源性较高的相关序列，ClustalW 软件进行多重序列比对后，采用 MEGA 7.0 软件分析，通过邻接法（Neighb-Joining）进行聚类分析和系统发育树构建，进而分析菌株的分类地位。
（3）苞卫抗性基因 hppd 的克隆
根据 CodeHop 在线分析软件设计简并引物，用于扩增 hppd 基因的保守区域；产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，连接 pMD19-T，转化 E. coli DH5α，送样测序。
（四）可行性分析
通过《微生物学》、《分子生物学》、《微生物学实验》、《分子生物学实验》、《微生物学大实验》等课程的理论学习以及实验实践，我已具备基本的微生物学实验操作方法以及问题的自我解决能力。而且所在实验室多年来在土壤微生物的分离、纯化、鉴定以及基因工程操作等方面已积累了丰富的经验，且基本具备微生物以及分子生物学相关的仪器和设备，所以本实验方案具备一定的可行性。
4. 研究创新点
相比于草甘膦等非选择性除草剂，苞卫除草剂对作物具有一定的针对性，且生产性能优良，对人类比较安全，在农业上应用广泛。
但是目前苞卫除草剂抗性 hppd 基因的筛选和利用还没有报道，所以能够筛选获得具有苞卫高抗性靶标基因的微生物资源具有潜在的意义和价值。
5. 研究计划与进展
（一）研究计划
2018年10月-2019年3月：查阅各种相关文献（包括查阅资料、外文文献翻译），设计实验方案；
2018年10月-2019年5月：根据实验方案，分离纯化获得苞卫抗性菌株，并对其进行分子生物学鉴定以及生物学特性的分析等；
