1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：研究稻瘟病菌基因mgg_09531和mgg_11676的功能，探究其对稻瘟病菌生长的影响。
研究内容：本课题主要通过载体构建和t-dna转化敲除目的基因，通过基因特定的pcr确定敲除突变子，通过表型观察验证稻瘟病菌突变体基因敲除后的活性，最终验证其基因的功能。
3. 研究的方法与方案
研究方法：1.上下游片段的扩增
在NationalCenter f Biotechnology Infmation（NCBI）窗体顶端窗体底端网站获得目的基因序列及上下游序列，设计引物并通过PCR扩增相应片段。
2.敲除载体的构建
双酶切获得线性载体。将各重组片段进行酶连，之后利用农杆菌感受态细胞进行重组产物转化。
3.基因特定的PCR验证
挑取农杆菌单菌落，接种于LB液体培养基上过夜培养。取部分菌液进行PCR，验证是否转化成功。
4.真菌基因敲除（ATMT）
农杆菌菌液与稻瘟病菌分生孢子悬浮液共培养，之后接种到含相应抗性的培养基上进行培养，直至长出转化子。
5.表型观察
将冷冻保存管中的稻瘟病敲除突变体菌接种于CM培养基上进行活化，观察菌落生长情况，测量菌落直径，计算其生长速度。
技术路线：
实验方案：
实验材料：稻瘟病菌野生型菌株 Guy11
一、上下游片段的扩增
依据MGG_09531和MGG_11676基因名，在NCBI窗体顶端窗体底端网站获得目的基因序列及上下游序列，运用CE design软件设计引物，通过PCR扩增相应片段。
PCR反应扩增条件：
95℃ 5 min
95℃ 15sec
61℃ 30sec 30 cycles
72℃ 80 sec
72℃ 10 min
10℃ 5min
二、敲除载体的构建
1.用BamⅠ和HindⅢ进行酶切构建线性载体。
双酶切体系：
| 反应成分 | 体积（μL） |
| 1300线性化载体 | 45 |
| CutBuffer | 4 |
| 酶 | 1 |
2. 试剂盒回收纯化各片段
1）PCR产物放在1.5mL离心管中加Binding Buffer 200μL。
2）将液体转移至DNAmini colums中，DNA mini colums放在收集柱中，10000rpm，1min。
3）将收集管中液体倒回收集柱中，重复步骤2）。
4）弃甩出液，加Binding Buffer300μL，10000rpm，1min。
5）弃甩出液，加SPW Wash Buffer700μL，10000rpm，1min。
6）重复步骤5）。
7）弃甩出液，空株离心12000rpm，3min。
8）将收集柱放入1.5mL离心管中，吹风吹3-5min。
9）加入50μL外用ddH2O，37℃培养箱温浴2min。
10）离心12000rpm，2min，弃出集柱，-20℃保存。
3.重组反应
酶连体系：
| 组分 | 体积（μL） |
| 线性化载体 | 3.5 |
| 3个插入载体 | 1 1 1 |
| 2×ClonExpress Mix | 5 |
50℃水浴，30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
4. 农杆菌转化
1）将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻（农杆菌AGL1化学感受态细胞）。
2）取5-10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀（请勿振荡混匀），冰上静置30min。
3）42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min。
4）加入900μL LB液体培养基（不添加抗生素），37℃摇菌1h（转速200-250rpm）。
5）将相应抗性的LB固体培养基平板放在37℃培养箱中预热。
6）5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。
7）37℃培养箱中倒置培养12-16h。
三、基因特定的PCR验证
挑取农杆菌单菌落，接种于含有相应抗性的LB液体培养基上过夜培养。取部分菌液进行常规PCR，验证是否转化成功。
四、真菌基因敲除（ATMT）
以转化农杆菌的pCAMBIA1300载体中含卡那霉素和潮霉素抗性基因为例
1) 从培养好的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上挑选农杆菌单菌落，接种于LB液体培养基(含50 μg/ml卡那霉素)，28℃ 200rpm过夜培养。
2) 将 200-400 μL上述培养液转移到 5 mL含 50 μg/mL卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，28℃培养5-6h。
3) 用适量无菌水从培养7-10天的CM平板上洗下稻瘟病菌分生孢子，三层擦镜纸过滤后血球计数板计数，再用无菌水将孢子浓度稀释到1×106个/mL。若无分生孢子，可用洗下的气生菌丝代替。
4) 取 100 μL新鲜培养的农杆菌AGL1菌液与100μL稀释好的稻瘟病菌分生孢子悬浮液相混合，然后均匀地涂于AIM平板上的硝酸纤维素膜表面。22℃共培养48小时。
5) 将硝酸纤维素膜切成条状并转移到含多种抗生素的选择平板上这些抗生素包括：200μg/mL潮霉素（HygromycinB），400μg/ml 头孢霉素 （Cefotaxime）和 60 μg/mL链霉素（Streptomycin）等。将平皿置于28℃黑暗培养箱中培养，直至生长出转化子。
6) 将转化子转接到含200 μg/mL 潮霉素的CM平板上,再次检验转化子是否具有潮霉素抗性。
五、表型观察
将冷冻保存管中的稻瘟病敲除突变体菌接种于CM培养基上进行活化，观察菌落生长情况，测量菌落直径，计算其生长速度。
可行性分析：本课题主要通过载体构建和T-DNA转化敲除目的基因，通过基因特定的PCR确定敲除突变子，通过表型观察验证稻瘟病菌突变体基因敲除后的活性，最终验证其基因的功能。本实验具有超净工作台、恒温培养箱、PCR仪等相关仪器设备及丰富的稻瘟病菌及麝香霉资源，具有实验相关条件，能确保实验的顺利进行。
4. 研究创新点
分析了稻瘟病菌基因mgg_09531和mgg_11676的功能，将填补关于稻瘟病菌及麝香霉的相互作用研究的空白，为麝香霉成为新的生物纺织菌剂提供理论依据。
5. 研究计划与进展
研究计划：
研究计划：2018年11月——2019年1月查找相关文献，学习相关基本操作，了解课题思路
