1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1研究意义
越来越多的消费者、医生和研究人员认识到，人类的消化道被数以万亿计的细菌所占据，这些细菌殖民者的种类与数量与人类健康有着十分密切的关系，在肠道细菌群体中最值得关注的就是益生菌。“益生菌（probiotics）”一词来源于希腊语，意思是对“对生命有益”[1]。益生菌是一类具有活性的微生物，有正式报道表明，当特定的一种或者几种稳定组合起来并摄取一定的剂量，可对宿主的健康产生积极作用[2,3]。
虽然益生菌对人体健康益处的确切机制尚不清楚，但许多证据表明，益生菌通过直接或间接影响肠道菌群的定植而发挥作用[4,5]。益生菌可以通过多种机制直接影响殖民微生物,包括抑制如细菌素、短链脂肪酸等化合物的生成[6],生产可能促进殖民微生物的生长基质如维生素、脂肪酸和碳水化合物等,又或者促进对特定微生物的免疫反应。益生菌也可以通过刺激粘蛋白的产生[7]，增强肠道屏障效应，降低肠道炎症的调节[8,9]，从而间接影响微生物的定植，促进与更健康的肠道生理相关的微生物的生长。益生菌摄入和定植引起的菌群变化包括相关系统类型数量的增加，病原体及其毒素的减少，改变细菌群落结构以增强均匀性，在受到干扰时稳定细菌群落(如使用抗生素)，或促进从干扰中更快地恢复[10-12]。迄今为止的研究表明，只有持续摄入益生菌，益生菌对健康的促进效果才较为显著[13]。
正是由于肠道微生物群与人类健康之间的密切联系，思考让食品、饮料或膳食补充剂中的益生菌如何在人类消化道中长时间定植显得尤为重要[14]。然而益生菌一般不会在消化道或人体的其他部位定植，有研究结果表明摄入的益生菌有大部分都随粪便排出[15]。为了实现定植，益生菌应该可以繁殖并形成一个稳定复制的种群。在发现益生菌定植或长期存在的情况下，定植潜力被认为是特定于某些个体的更宽松的肠道菌群。无论哪种情况，为了实现定殖，任何引入的益生菌都必须克服现有稳定生态系统固有的重要生态限制[16]。因此使用外源性物质帮助益生菌更好的定植是非常有研究潜力的。
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标与内容
本实验以大肠杆菌nissle1917作为基因工程的受体菌，将来源于实验室保存的dpe基因克隆,利用重叠延伸pcr获得脂蛋白启动子lpp-sd-dpe和lac-sd-gfp片段，通过red同源重组技术将两段基因转化到ecn染色体中，添加d-阿洛酮糖来维持ecn在肠道内的定植作用，并通过绿色荧光蛋白来活体观察ecn在肠道内的定植效果。本实验的目标是以益生菌为基因工程的受体菌，使之表达一些有用的外源基因，扩大其生物学功能，构建出粘附定植力强且稳定的菌株，既能保持受体益生菌株的安全性和在肠内定植、繁殖功能,又能发挥其调整菌群和促生长的有益特性。
2.2拟解决的关键问题
（1）验证大肠杆菌nissle1917；
（2）克隆dpe基因并完成相关验证；
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
（1）挑选ecn单菌落作16s检测测序，作blast进行比对；
（2）通过ctab法得到基因组dna，并扩增目的基因；
4. 研究创新点
益生菌在肠壁上的黏附是其定植并大量繁殖变成优势种群的一个重要前提,所以黏附力的强弱是筛选益生菌菌株的重要标准之一。
但是依靠益生菌自身有限的存活于黏附能力很难在众多肠道微生物中生存下来。
因此,本研究设想通过基因工程技术,使d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在ecn中外源表达，通过在喂养中添加其他微生物难以利用的外源物质d-阿洛酮糖，提高ecn的定植能力,让暂住性ecn获得“永久性”定居因子,以便益生菌能够在肠道持续发挥作用,甚至可以“代代相传”。
5. 研究计划与进展
3.3实验方案
3.3.1大肠杆菌nissle 1917验证
3.3.2 ecn-dpe工程菌构建
