1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
钾是植物体内含量最丰富的营养元素之一，在维持离子稳态、渗透调节、蛋白代谢、酶活、膜极化和各种代谢过程中起关键作用。植物重要的生理过程，如光合作用、光呼吸以及生长发育，均受到钾的影响[1]，植物缺钾后会表现出生长缓慢、叶片黄化、茎秆柔弱易倒伏等症状[2]。农业生产中，钾与氮、磷一同被称为“肥料三要素”，钾肥供应充足不仅可以促进植物生长发育，还可以提高植物对各种逆境胁迫的抗性，如高盐、干旱、低温和病原菌侵染等[3]。我国土壤质量普遍偏低，缺钾和极缺钾土地面积约占12.16%[4]，严重制约了农业生产和农民增收。因此，研究植物钾吸收及其调节机制对基因工程提高作物钾吸收能力和钾肥利用效率具有重要意义。
利用模式植物拟南芥，已对植物钾营养的吸收和分配机制进行深入解析。植物对钾离子的吸收主要依靠钾离子通道，而拟南芥根系吸收钾离子主要依赖内向钾离子通道akt1和钾转运蛋白hak5[5]。在sf9 昆虫细胞中的异源表达的序列分析表明，akt1基因的 cdna 编码内向整流钾离子通道属于 shaker家族[6]，而shaker 钾离子通道对植物钾离子吸收起关键作用[7]。相较于可被铵盐强烈抑制基因表达及转运体活性的hak5[8]，akt1的钾转运活性几乎不受铵根影响，在氮肥施用量日益增加的农业生产中，akt1在改良作物钾吸收效率上可能更具实际意义。
在拟南芥和水稻中已证明，低钾胁迫可以引起胞内钙信号的产生[9]，钙信号会被质膜上的钙感受器cbl1/9识别。随后cbl1/9与蛋白激酶cipk23的fisl结构域结合，将胞质中的cipk23牵导到质膜附近，同时改变cipk23的构象并激活其激酶活性，促使cipk23磷酸化质膜钾通道akt1，从而激活akt1，促进根系对钾离子的吸收[10-12]。此外，cipk23对akt1的磷酸化可以被碱性磷酸酶aip1去磷酸化，使得akt1失活；并且aip1还能与cipk23互作，抑制其激酶活性，而这种抑制作用又能够被aip1与cbls的互作解除。类似的还有cbl10能够直接结合akt1并抑制其通道活性；shaker家族钾通道成员atkc1可以和akt1组成异源四聚体，使得akt1激活电压负向偏移，抑制低钾胁迫下akt1介导的离子外漏，提高拟南芥对极低钾环境的耐受性，同时akt1-atkc1门控特性会因atkc1与一些snare蛋白互作而改变，并充当囊泡与质膜融合的支架；r-snare蛋白vamp721则可与atkc1结合，在将囊泡带到质膜附近的同时，抑制akt1-atkc1的活性，随后qa-snare蛋白syp121通过与vamp721换位结合atkc1，恢复akt1-atkc1的通道活性，并促进囊泡与质膜融合[13-15]。
2. 研究的基本内容和问题
为了实现明确磷脂酸信号参与拟南芥低钾胁迫应答过程、解析PLD及磷脂酸信号调节拟南芥响应低钾胁迫的分子机理，实验计划检测PA、PLD与钾离子通道AKT1及AKT1的调控元件（CBL1/9/10、CIPK23、KAB1、AIP1、AtKC1、SYP121和VAMP721等）是否存在相互作用，并确定影响相互作用的关键氨基酸位点。具体可通过NC膜免疫显色和脂质体沉淀法检测PA与蛋白的互作；利用酵母双杂交、BiFC和Co-IP方法检测PLD与AKT1或AKT1的调控元件的互作。
希望通过实验能验证出磷脂信号分子PA在植物响应低钾胁迫中，是否参与钾离子通道AKT1的调控，并确定其在调控机制中的互作蛋白。
3. 研究的方法与方案
通过PA-蛋白互作检测利用原核表达系统、Sf9昆虫细胞真核表达系统表达纯化得到的AKT1及AKT1调节蛋白进行PA-蛋白互作检测实验：（1）NC膜免疫显色法：将PA和其他脂类均匀地点在NC膜上，晾干后放入脱脂的BSA中封闭，经与待测蛋白孵育、一抗、二抗孵育和洗涤等过程，最后用碱性磷酸酶（AP）显色试剂盒显色。（2）脂质体沉淀法：将PC和PA按照3:1摩尔比混合，吹干，于水化缓冲液中孵育后涡旋过滤，超速离心后，沉淀重悬于结合缓冲液制成脂质体。将脂质体与待测蛋白混合，4度孵育1小时，高速离心，沉淀经洗涤，跑SDS-PAGE，转膜进行蛋白免疫显影。
本实验重点在于检验PA与钾离子通道AKT1及其调节蛋白是否存在互关系，已有研究证明PLD与PA参与钙信号介导的植物低钾信号转导，且前期工作展现PA于AKT1存在调节作用，实验旨在找出直接与PA互作的蛋白，重点仅在操作，充分可行。
4. 研究创新点
本研究课题创新之处在于开展对PA参与低钾信号转导的探究。近年来，磷脂信号在调节植物生长发育和盐、旱等非生物逆境响应过程中的作用已成为植物生理学研究的热点，但是磷脂信号是否参与调节植物对营养元素的吸收利用尚不明确。而钾作为我国作物大量需求，土地含量却较低的必需元素，在植物内的信号转导研究较全面，却缺乏对PA在其中作用意义的研究。明确PLD和PA参与拟南芥对低钾胁迫的应答，有利于对植物钾离子通道的调控机制更深入的研究，还有助于拓展对植物磷脂信号途径的认识。同时也可以为提高作物钾吸收利用效率提供新的理论参考和潜在的遗传操作靶点，在科学研究和农业生产上都具有发展意义。
5. 研究计划与进展
本实验计划从2019年10月开始进行，于5月结题。前期为准备与熟悉工作，条件充分、实验计划制定完全后开始实验。预期5月底可实现PA互作蛋白的确定，及具体位点的定位。
