1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
磷脂作为构成细胞膜的主要组分，与膜的流动性、膜结合酶的活性以及植物抗逆性等息息相关（汤章城1981）。其中，二酰甘油（diacylglycerol,dag）是由一个甘油分子的三个羟基中的两个羟基和两个脂肪酸缩合失去两分子水形成的酯，是激素信息传递的磷酸肌醇系统中具有第二信使作用的化学信息分子。当激素、神经递质与膜受体结合后，激活g蛋白介导的磷酯酶c（phospholipasec,pkc），从而催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphatidylinosital biphosphate,pip2）水解产生肌醇三磷酸（inositol triphosphate,ip3）和dag，ip3进入胞浆，dag留在膜内（刘景生1987）。dag招募信号蛋白，如蛋白激酶c异构体、ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白和嵌合蛋白，从而在dag产生的膜区激活它们（nishizuka1992;newtonand chem2001）。通过信号蛋白的空间调节激活，dag控制着广泛的细胞功能，例如调节从高尔基体到质膜的囊泡运输和细胞增殖（yangetal.,2003;baronand malhotra2002;bivona2003）。因此，要了解dag如何调节细胞功能，就必须找出dag浓度在活细胞中在何处、何时以及在何种程度上增加和/或减少。不幸的是，没有获得令人信服的方法来分析dag在活细胞中的时空动态。为了解决这一限制，之前的研究者们基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,fret）开发了dag基因编码荧光指示剂。将这个指示剂系在质膜或细胞器上，通过将其与特定的膜定位序列（membrane localization sequences,mlss）融合，就能使dag浓度的局部检测成为可能。为此，本课题将进一步对dag探针进行开发和研究并期望能够将其应用到植物的生长发育以及抗逆作用中。
此前研究表明，通过由重复的eaaar序列组成的刚性α螺旋接头融合了蛋白激酶cβ上定位在青色和黄色荧光蛋白之间的富含半胱氨酸的结构域（cysteine-rich domain,crd）是一个特定的dag结合域（satoetal.,2003）。当细胞膜上产生的dag与crd结合后，会导致指示剂构象发生变化。这种触发器式的构象变化导致从cfp到yfp的fret增加，并允许通过双发射比成像稳定观察dag。这些指示剂被命名为“daglas”，一共有三种，分别是daglas-pm1、-em1和-mit1。其中，daglas-pm1用于检测质膜上的dag动态；daglas-em1是内膜靶向dag传感器，它在内质网和高尔基体的表达导致内膜定位荧光；daglas-mit1定位于线粒体，用于在线粒体外膜上检测dag。接下来利用madin-darby canine kidney（mdck）细胞研究配体诱导的daglas pm1、-em1和-mit1的fret反应。可以知道的是当cfp和yfp并列时会产生较高的fret，yfp与cfp分离，会降低fret，cfp/yfp发射比增加，表明fret的丧失（wangetal.,2005）。使用表观荧光显微镜下在440±10n m处激发了一个表达daglas的mdck细胞，并监测了cfp与yfp的发射比，以观察fret。结果表明，daglas-pm1、-em1和-mit1通过crd与dag结合后发出fret信号。最后，通过光漂白实验证实了fret在daglas内发生。
最终研究结果表明，可将daglas传感器拴在感兴趣的细胞器膜上，从而对dag进行局部分析。此外，daglas还提供了一种基于fret的读出，它在量化方面具有优势。总体结果表明目前的方法在可视化活细胞中dag的时空动态上具有优势（sato etal.,2006）。
铵是植物的主要无机氮源，是根系吸收的主要无机氮形式之一（zhouet al.,2015）。 在较低的外部供应时，铵促进植物生长，而在较高的外部供应时，铵引起毒性。大多数物种的根更喜欢吸收铵而不是硝酸盐（gazzarriniet al.,1999），铵的毒性会抑制根和茎的生长。根细胞对铵暴露的直接生理反应是质膜的短暂去极化（wangetal.,1994）。此前研究表明，根系重力性反映了细胞对光照刺激的不平衡扩张强度，是由生长素在根顶端的不对称分布引起的（bandetal.,2012）。与铵对原根伸长的抑制作用一致，铵还能抑制根的重力性（zouet al.,2012;liuet al.,2013）。这一现象与生长素出口者pin2的表达显著降低以及随后在根伸长区不对称生长素分布的延迟有关，表明pin2依赖的不对称生长素流是铵诱导的农业作物病的关键靶点（liuet al.,2013;zouet al.,2013）。除了pin2，对重力1的改变反应（altered response to gravity 1,arg1）通过维持pin3介导的侧生长素分布和aux1促进的根向生长素回流，在铵供应下恢复根系重力性（zouet al.,2013）。因此，在铵供应下有缺陷的根重力现象受到pin2和arg1依赖的生长素流之间的拮抗作用（zouetal.,2013）。铵与生长素在植物生长、发育和逆境响应等重要过程中均有一定的作用。因此，本课题将利用dag生物探针，检测在铵盐处理下拟南芥根系细胞中dag和生长素的活动状态。
2. 研究的基本内容和问题
本课题的研究目标和内容是开发出新的DAG探针并基于DAG生物探针探索DAG对生长素、盐信号的应答模式。具体表现为：构建基于 FRET 框架的 DAG 生物探针，确保其可以满足具备高度特异性、制备与标记容易,以及探针的杂交必须稳定等要求。之后验证其是否特异指示细胞 DAG变化。最后，利用 DAG 生物探针实时检测各种处理下，DAG在根尖的动态变化。同时明确DAG是否受铵盐、生长素的调控作用。
拟解决的关键问题：探针的具体制备方法，探针的荧光检测和组织定位，探针的准确性和灵敏性及其影响因素等。
3. 研究的方法与方案
本实验以拟南芥、烟草为主要材料，进行如下实验:
1.dag探针的制备
在本实验室已有的pa探针的基础上，将标记pa的区域切除，连接dag的特异结合区域pkcβ-1，构成三种不同的探针。一种载体末尾加上一段可以上膜的多肽构成dag的质膜探针，另一种在此基础上将dag特异结合位点的三个氨基酸突变，构成dag质膜探针(mutant)，最后一种在第一种的基础上再加入一段上核膜的多肽使其可以在核膜表达以探究核膜的dag变化。
4. 研究创新点
当今时代，对于事物的研究越来越细化，对植物的研究也从表观进行到微观阶段，再进行到细胞和分子阶段。此前对于植物磷脂方面的研究大多是磷脂的分类、结构性质、功能以及区别和作用等方面。此外，还有很多关于磷脂酶的种类及作用机理的研究。而DAG作为磷脂酶水解磷脂产生的小分子物质,对其进行的研究还比较少。而在这些研究中主要的部分是DAG作为细胞内第二信使在细胞信号转导中所起的作用这一方面。可以知道的是，细胞内有五种最重要的第二信使:cAMP、cGMP、DAG、IP3和Ca2 ，并且Ca2 是植物中主要的第二信使，而DAG只是天然植物油脂的微量成分。因此，DAG作为第二信使在植物内有哪些作用还有待进一步研究。目前，国内外对于生物探针方面的研究较多，许多种类的荧光探针已经被开发并投入使用。根据我们了解到的情况，很多荧光探针可用于核酸的检测以及组织定位等比较静态和常规的检测。DAG探针也属于荧光探针的一种，同样依据于FRET，然而与上述荧光探针不同的是，它可根据CFP/YFP的发射比来判断DAG在细胞膜上的动态变化。当然，DAG的检测方法远不止已经研究出来的这些，还有更多更简便的方法等着我们去发现和应用。
5. 研究计划与进展
2020年2月-2020年3月：设计实验方案并准备好实验相关材料。
2020年4月-2020年5月：dag探针的设计与制备；探针的表达与组织定位；利用已经制备而成的dag生物探针探索dag和生长素在铵盐处理下，在植物根尖细胞内的动态变化。
2020年5月-2020年6月：整理实验数据，撰写论文，准备答辩。
