1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
意义：
本课题旨在通过猪捷申病毒2a （porcine teschovirus-1 2a, p2a）的自裂解效应，利用异位oshkg1的过表达能够在诱导水稻（oryza sativa）愈伤组织形成过程中筛选出阳性转基因愈伤组织的功能，来提高腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editors, abes）在水稻中的编辑效率。（1）2a肽是存在于多种病毒中、含有共有基序asp-val/ile-glu-x-asn-pro-gly-pro的相对较短的多肽，其长度为18-22个氨基酸（felipe p d et al., 2004）。（2）2a肽的分割位点均位于甘氨酸残基与脯氨酸残基之间。因为核糖体遇到2a肽会发生跳跃，所以位于同一条mrna的两个基因会翻译成两个单独的蛋白（palmenberg a c et al., 1992）。分割后的短2a肽保持与上游蛋白的c端融合，脯氨酸与下游蛋白的n端融合（doronina v a et al., 2008）。本实验利用的是p2a（kim et al., 2011;kuzmich et al., 2013）。（3）hkg属于harp超家族的转录因子，首次被鉴定在玉米（zea maysl.）中，普遍存在于高等植物中，其编码的转录因子能够起到促进叶绿体发育的调控机制（fitter d wet al.,2010）。（4）水稻中有一对hkg基因，分别为oshkg1和oshkg2。oshkg1主要表达于维管束鞘细胞中，oshkg2主要表达于叶肉细胞中，两者都能够调节原质体分化为叶绿体，在一定程度上功能冗余（rossini l et al., 2001）。（5）含oshkg1-fox（oshkg1full-length cdna over expresser）序列的水稻愈伤组织在含2,4-d的愈伤组织诱导培养基（n6d）且光照条件下呈现绿色，而野生型水稻愈伤组织在相同环境下呈现象牙色。另外，oshkg1-fox愈伤组织还能在缺乏蔗糖的培养基上生长（nakamura h et al., 2009）。（6）一般认为碱基突变率与cas9蛋白的含量有关。含oshkg1-fox序列的水稻愈伤组织能够表示cas9蛋白的高水平表达，其突变率会比野生型水稻愈伤组织更高（wang z p et al., 2009）。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
（1）本实验所用的水稻材料为日本晴（nipponbare）
（2）通过构建crispr/cas载体并转化到水稻愈伤组织中，验证含oshkg1-fox序列的水稻的碱基编辑效率比野生型高
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）golden gate克隆原理
golden gate克隆法所使用的type iis限制性内切酶是一组比较特殊的内切酶，其包含2个结构域，一个负责识别序列，另一个负责非特异性地在识别位点下游进行切割，两者被一个多肽连接子分开（carolaet al., 2008; carolaet al., 2009）。该方法的具体原理是在同一反应体系中，利用type iis限制性内切酶在识别位点之外切开dna，产生含粘性末端的dna片段，同时用连接酶将几个dna片段按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的dna片段，使多个目的dna片段按照设定的顺序实现“无缝”连接（bickle et al., 1993; morbitzer et al., 2011）。
4. 研究创新点
（1）2a肽的核糖体跳跃技术是一种新型技术，目前在植物中的研究较少，且集中于口蹄疫病毒2a（foot-and-mouth disease virus2a, f2a）在植物中的应用研究。
（2）目前还没有关于标记基因能够提高腺嘌呤碱基编辑器在植物中的编辑效率的相关研究和文献。
5. 研究计划与进展
2020.02（1）构建crispr/cas载体
（2）诱导水稻愈伤组织并完成转化
2020.03阳性愈伤组织的筛选和再分化
