1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义：镉污染是农田土壤最具有毒性的污染之一，在我国农田土壤中，镉的浓度远远超过了土壤背景值，研究表明，我国镉污染农田土壤面积已达2000万hm2, 约占总耕地面积的1/6 [1]。cd作为生物非必需元素，具有移动性强，化学活性高，半衰期长，难降解等特点。cd被小麦根系吸收后，经转运装配，在小麦体内大量积累，使光合作用、呼吸作用、碳代谢、氮代谢等一系列的生理生化代谢受到抑制，从而使得小麦的正常生长发育受阻[2]，小麦是人类种植在镉污染土地上的小麦也会吸收并在体内积累镉，最终直接或经过食物链被人类食用。由于cd在人体内的半衰期通常可达10～30年，人若长期摄入含有cd的食物，将会使cd在人体内大量积累进而对人体健康造成严重危害[3]。探究缓解小麦镉胁迫的方法，提高小麦产量和质量，对人类健康具有很大的意义。
国内外研究概况；甘露糖是一种单糖，是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，广泛分布于体液和组织中，参与人体的免疫调节，大量研究发现甘露糖参与植物抗逆性，低浓度甘露糖（2.0 mmol·l-1）浸种预处理能显著提高干旱胁迫下白三叶种子的萌发,提高干旱胁迫下种子萌发时根系生长、根系活力和淀粉酶活性,有效缓解干旱胁迫抑制的淀粉分解[4]，甘露糖也是白三叶草生长和适应水胁迫的重要调节因子，可以缓解其受到的水胁迫[5]。甘露糖增强职务的抗逆性与甘露糖结合型凝集素基因相关[6]。最近已有研究表明甘露糖参与植物对镉的富集，外源施加甘露糖的拟南芥对镉的吸收增加，特别是根部会积累更多的重金属镉[7]；在镉污染土壤中施加甘露糖后小白菜3个品系的生物量均增加, 测定植物组织镉质量比发现，甘露糖的质量比在200mg/kg以内随着甘露糖质量比的增加, 小白菜对重金属镉的吸收量也随之升高[8]。与甘露糖缓解植物受镉胁迫的相关基因以及作用机制也被发现，有研究表明甘露糖参与了拟南芥myb4-man3-mannose-mnb1的信号通路，可以调节镉胁迫和镉积累，man3定位于细胞间隙,编码的蛋白具有p-甘露聚糖水解酶酶活性,man3能够被镉诱导表达,从而增加体内甘露糖含量，甘露糖结合拟南芥中mnb1基因，通过gsh依赖的pc合成途径正向调控拟南芥对镉的积累和耐受[9][10]。
虽然参与甘露糖缓解植物镉胁迫的部分基因和作用机理已经被探明，但甘露糖缓解重要的粮食作物小麦受镉胁迫的功能基因尚不明确，实验室已经验证了甘露糖具有缓解小麦镉胁迫的作用，且通过蛋白质组学找到差异蛋白，并找了出来差异蛋白相关基因，验证这些功能基因的工作亟待进行。
2. 研究的基本内容和问题
项目研究目标： 1.验证小麦细胞壁相关基因cad2、prx135、pectinesterase以及gstu2在甘露糖处理下特异性表达水平提高； 2.讨论这些基因在甘露糖缓解小麦镉胁迫中的作用机理。研究内容：1.荧光定量pcr验证小麦基因cad2、prx135、gstu2、pectinesterase在甘露糖处理下特异性表达水平的提高； 2.分析结果并做出这些基因随处理时间特异性响应表达的曲线； 3.运用生信技术讨论这些基因在甘露糖缓解小麦镉胁迫中的作用； 4.补充植物生理实验验证这些基因是否参与甘露糖缓解小麦镉胁迫。拟解决的关键问题： 验证参与甘露糖缓解镉胁迫相关基因的特异性表达水平的提高，研究这些基因在甘露糖介导下缓解小麦镉胁迫的机理。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
拟采取的研究方法和实验方案
1. 荧光定量pcr验证基因特异性表达
用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 分别提取对照、镉胁迫、外施甘露糖、镉胁迫下外施甘露糖四组小麦地上和地下部分的总rna，利用紫外分光光度计进行浓度和纯度的检测，根据浓度调整rna的加样量，利用反转录试剂盒合成cdna，分两个反应过程：1）去除基因组DNA，反应体系如下:
| 试剂 | 使用量 |
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2.0 μl |
| gDNA Eraser | 1.0 μl |
| Total RNA | |
| RNase Free dH2O | up to 10 μl |
42℃ 2 min（或者室温 5 min） ，4℃保存。2）反转录反应，反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数 2 的量配制 Master Mix，然后再分装 10 μl 到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应：
| 试剂 | 使用量 |
| 上一步反应液 | 10.0 μl |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 μl |
| RT Primer Mix | 1.0 μl |
| 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） | 4.0 μl |
| RNase Free dH2O | 4.0 μl |
| total | 20.0 μl |
37℃ 15 min ，85℃ 5 sec ，4℃保存。设计待检测基因的上下游引物，使用96孔板在冰上配制25ul的pcr反应液，反应体系如下：
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（2×） | 12.5 μl | 1× |
| PCR Forward Primer（10 μM） | 1.0 μl | 0.4 μM |
| PCR Reverse Primer（10 μM） | 1.0 μl | 0.4 μM |
| RT 反应液（cDNA 溶液） | 2.0μl | |
| 灭菌水 | 8.5 μl | |
| Total | 25.0 μl |
短暂离心使得反应液混合均匀，将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应，反应程序：Stage 1：预变性 Repeat：1 95℃ 30 秒 ；Stage 2：PCR 反应 Repeat：40 95℃ 5秒， 60℃ 30-60 秒。反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。
2. 基因功能的研究
利用NCBI等基因和蛋白质数据库，分析所需研究基因的具体信息、表达产物等，预测和构建对应蛋白质的结构和功能。
技术路线
可行性分析：
实验室软件条件：本项目所依托的南京农业大学植物生理实验室长期研究小麦镉胁迫相关内容，积累了丰富的经验，具有良好的工作基础。
实验室硬件条件：本课题直接依托于南京农业大学植物生理实验室，该实验室已经拥有从事植物生理、分子生物学方面的一些常规仪器，如高速离心机、紫外分光光度计、rt-PCR仪、PCR仪等，为本项目的完成提供了保证。
4. 研究创新点
国内外目前对于甘露糖缓解作物镉胁迫机理的研究不多，在小麦方面更是一片空白，本研究在实验室前期已经验证的甘露糖能够缓解小麦镉胁迫，通过蛋白质组学找到差异蛋白，找出来差异蛋白相关基因工作的基础上，进一步运用分子生物技术验证这些基因，并通过生物信息技术研究讨论这些基因在甘露糖缓解小麦镉胁迫过程中的具体功能，涉及的作用机理。
5. 研究计划与进展
研究计划：2019.11—2020.1 小麦幼苗培养，并进行不同的处理
荧光定量pcr验证基因的特异性表达
2020.4—2020.5 基因分析，进行蛋白质结构和功能预测分析
