1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
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大豆疫霉与大豆根腐病 大豆是我国重要的粮食作物和油料作物，在我国的东北、华北、西南等地区都有着广泛的种植。大豆可以用来制作豆腐之类的豆制品，还可用来榨油，生产过程中剩下的豆渣还是一种优质的高蛋白饲料，此外大豆还具有优秀的工业价值和药用价值，是一种重要的经济作物。 翻开农业的历史，从人类开始耕耘这片土地起，就开始和病虫害这个农业生产最大的敌人作斗争，大豆的种植也不例外，其中由大豆疫霉所引起的大豆根腐病是当前大豆生产当中最为严重的病害之一。大豆疫霉（Phytophthora sojae）属于藻物界、卵菌门、卵菌纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属，是土传性病害菌，在进化上相较于真菌，与藻类更为相近。1948年，大豆疫霉首次报道于美国的印第安纳州，之后蔓延至南北美洲并漂洋过海，对亚洲、澳洲、非洲、欧洲等地的大豆产区都造成了很大的影响。大豆疫霉在大豆从种子到成熟植株的各个生长阶段均可造成感染，感染方式主要是通过侵入大豆的根部来使大豆染病[2]，一旦感染就会使当株大豆所结豆粒劣化，影响产量，减少收成。被大豆疫霉感染的大豆会患根腐病，我国于1991年在东北地区首次发现由大豆疫霉引起的这种病症，之后在河北、山东等地也有发现。近年来随着对海外大豆进口量的增加，外国大豆疫霉传入我国的危险也随之产生。大豆疫霉会使被感染的幼苗和成体植株死亡[3]，对大豆生产造成极具破坏性的影响，因此，对大豆疫霉的防治迫在眉睫。 防治手段 对大豆疫霉的防治手段有许多，首先是培育抗性品种，就像人类对付疾病最为有效的手段之一是注射疫苗一样，培育出一种对大豆疫霉有抗性的品种进行栽培是控制病害的直接有效的方法，但是具有抗性的品种较少，培育周期较长，并且大豆疫霉比较易产生生理小种使原有的抗性效果打折扣，同时随着近年来农村对秸秆燃烧的管控，原有大豆植株上的大豆疫霉就有可能得到保留，这就为新的土传病害创造了条件也给防治造成了困难。目前广泛采用病害防治手段的主要还是化学防治，通过施用以甲霜灵为主的这些药物来抑制菌丝的生长[4]，但是长久采用化学防治的方法会由于施用药剂作用的单一性使得大豆疫霉产生抗性突变，同时还会给环境带来污染和农药残留等一系列的问题。为了达到持续有效的目的并且符合环境友好的条件，人们开始把探索的目标投向了生物防治。生物防治（biologicalcontrol）是指利用对植物无害或有益的生物及其代谢产物来控制有害生物的数量，将有害生物种群数量控制在经济阈值以下[5]。生物防治的机理主要是拮抗生物可以寄生在病菌体的体内或体表，直接杀死或是产生拮抗物质来杀死或抑制植物病原物，以及分泌一些具有溶菌作用的酶类来杀死病原菌或抑制病原菌的活性[6]。其中粘细菌是一类独特的新型抗病原菌资源。 粘细菌及其生防机制特点 粘细菌是一类具有滑动运动特点的土壤细菌，具有能够生成子实体这一生长特点。基因组复杂，有复杂的代谢过程，可以产生结构多样种类丰富的次级代谢产物，是继放线菌之后又一重要的次级代谢产物来源菌，也是生物防治技术所应用菌种里的新秀。人们对粘细菌的研究主要经历了四个阶段： 第一阶段是从1809年由德国植物学家Link发现了第一个粘细菌属：多囊菌属[7]开始。到1892年美国植物学家Roland Thaxter首次把标桩菌等从原来的真菌类划分到粘细菌中，并且描述了标桩菌的奇特生活史[8]这一阶段，主要是粘细菌的发现和对其生活史的认知。 第二阶段是1947至1976年间，在对粘细菌认知的萌芽期，发现了粘细菌可以产生具有抗细菌和抗真菌功能的生物活性物质，但当时尚未能鉴定这些物质的结构和种类[9]。 第三阶段是1977到1986年间，发现粘细菌所产生的40多种基本结构的代谢产物和200多个类似物[10]。 第四阶段，从1987年至今。有100多种基本结构的代谢产物以及不下600种的结构衍生物被人类确证，并且每年还都有新型结构的次级代谢产物被发现，这标志着对粘细菌的研究步入了飞速发展的阶段。 目前虽然已经从粘细菌中分离并确证了大量可以用于抗菌作用的次级代谢产物，但是关于粘细菌如何在植物病原菌控制这一过程发挥作用的研究还是较少。除了生成次级代谢产物之外，李周坤等[11]在珊瑚球菌属中发现了一种命名为GluM的新型外膜蛋白，该蛋白具有的β，1-6葡聚糖酶活性使其具有了广谱抗真菌性质。此外粘细菌中属于噬纤维菌属和堆囊菌属的还可以通过在细胞壁上形成孔洞的方式，造成菌丝体的裂解，并且捕食病原菌[12]。
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2. 研究的基本内容和问题
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大豆疫霉是一种在世界范围内对大豆生产危害极大的病原菌，可以造成大豆疫霉根腐病，带来巨大的经济损失，如何防治这种病原菌成为了农业生产上亟待解决的问题。生物防治正日渐趋于主流，粘细菌是生物防治中一种具有独特优势的生防细菌，在农业病害防治中的应用潜力巨大。本课题通过对粘细菌在大豆疫霉防治过程中作用机制的研究，分离出抗菌物质，并对该物质的生理生化特性以及作用方式进行研究，力求为大豆疫霉根腐病的生物防治找到有效的微生物资源。
实验室前期通过对粘细菌菌株Corallococcus sp. EGB与大豆疫霉平板对峙表现出了良好的拮抗性这一现象进行研究，初步得出了该菌的抗菌物质为蛋白类的这一结论。本课题绕此展开，对其表现出抗菌性的蛋白进行分离鉴定，找出作用靶点及信号传导方式，阐明其抗菌机制。
本课题主要对粘细菌菌株Corallococcus sp. EGB在大豆疫霉根腐病的生物防治中所起的作用，产生功能的蛋白类物质类型及其生化性质，和该蛋白对病原菌的作用方式进行探究。
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3. 研究的方法与方案
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1、研究方法 本课题的研究方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、DNA的提取和检测、蛋白纯化技术等 2、实验方案 1.1 抗卵菌蛋白的分离与鉴定 对粘细菌胞内破碎液进行分离纯化，将纯化后的蛋白溶液经过SDS-PAGE电泳后分析所得条带，并对得到的候选肽段进行基因组数据对比，根据匹配信息得到候选蛋白，再构建异源表达系统(如毕赤酵母表达系统)用重组蛋白测试其抗菌活性 1.2 探究抗菌蛋白的作用特点 1.3 鉴定抗菌蛋白的作用靶点 3、可行性分析 课题所在实验室围绕珊瑚球菌属EGB菌株及其在病原菌防治中的作用已开展了大量的研究，实验背景可靠，应用仪器、药品具备，为课题的开展奠定了良好的基础。导师崔中利教授具有丰富的执行经验，指导内容认真仔细且能切中要害，可以确保研究的顺利进行。故课题可行性强。
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4. 研究创新点
| 目前生物防治尚且处于起步阶段，大多数的生防菌在实际应用的表现上不尽理想，而粘细菌在生物防治方面具有着先天性的优势，是一类具有巨大应用潜力的独特的微生物资源。此外，对大豆疫霉这类卵菌起作用的抗卵菌蛋白目前报道尚缺，一种具有高效、安全、环保的抗菌蛋白的发现对农业病害防治意义重大，明确其作用机理将会使我们能更深入了解这两类菌群的互作关系，进而为今后的大豆疫霉根腐病防治工作提供更好的生物资源。
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5. 研究计划与进展
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研究计划 2019.9.20-2019.10.7 查阅文献和收集资料，拟写文献综述 2019.10.8-2019.11.2 抗卵菌蛋白的分离纯化 2019.11.2-2019.12.2 抗卵菌蛋白的鉴定及异源表达 2019.12.2-2020.2.29 抗卵菌蛋白作用靶点的鉴定与验证 2020.2.29-2020.4.30 收集整理实验数据，撰写毕业论文 2020.5.1-2020.5.25 修改并完成毕业论文 2020.5.26-2020.6.6 毕业论文答辩
预期进展 能够确认EGB中抗卵菌蛋白的类型及其生化性质，阐明其作用机理 能够鉴别大豆疫霉中的抗菌靶点及其信号传导过程
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