灵芝线粒体细胞色素c氧化酶亚基的表达纯化开题报告

灵芝(学名:Ganodermalucidum)是具有重要医疗保健价值的一类真菌，具有保肝解毒、改善心血管系统等功效。近年来，国内外灵芝市场需求激增，高品质灵芝的开发成了急需解决的问题。而对灵芝中特定蛋白的功能研究，能够为利用基因工程手段提高灵芝品质提供分子基础。

细胞色素c氧化酶在细胞呼吸中处于细胞色素系统的末端，是一种存在于细菌或线粒体上的大型跨膜蛋白复合物。由于细胞色素c氧化酶是呼吸电子传递链的第四个中心酶复合物，因此又被称为复合物IV。此酶可以接受来自四个细胞色素c的四个电子，并传递到一个氧气分子上，将氧气转化为两个水分子。前期研究发现在沉默与合成鞘脂相关的基因后，线粒体呼吸显著下降^[1]，推测鞘脂可影响某个线粒体复合物的活性。因此，表达纯化各线粒体复合物的蛋白，研究鞘脂对其活性的影响，能够揭示鞘脂影响线粒体功能的机制。本课题拟体外表达纯化线粒体复合物IV——细胞色素c氧化酶的亚基，这一实验结果能够为研究鞘脂是否通过影响线粒体复合物IV活性调控线粒体功能提供前期实验基础。

随着体外DNA重组技术和蛋白质分析技术的迅猛发展，外源蛋白表达技术成为了现代最重要的生物技术之一。自20世纪70年代基因工程技术诞生至今^[2]，基因工程技术已经成为近代生物技术中必不可少的一部分。基因工程技术以分子生物学、分子遗传学、生物化学等学科为基础，在体外构建目标DNA分子，达成改变生物体原有的遗传特性以及性状的目的。外源蛋白表达技术通过构建表达载体，将目的基因载入受体细胞进行表达，获得目标蛋白，使基因工程技术构建的重组DNA分子得以在体外得到表达和研究。同时，目标蛋白的分离纯化技术为体外蛋白研究奠定了坚实的基础，并不断地发展，纯化效率和质量不断提高，为体外蛋白研究减少了障碍。

目前，蛋白表达系统主要有原核表达系统、真核表达系统和杆状病毒表达系统等。^[3]本课题采用原核表达系统的大肠杆菌表达系统进行实验。大肠杆菌表达系统相较于其他载体，能够更高效、高产量、高成功率地表达外源基因，是目前应用最为广泛的表达载体。大肠杆菌作为一种原核生物，结构较为简单，培养技术难度低、表达水平高、生长速度快。同时生产成本较低，适用范围非常广泛，是非常理想的表达系统。

蛋白纯化是体外蛋白研究必不可少的一项技术。目前对蛋白纯化的原理主要是利用其物理化学性质的特殊差异，如溶解度、分子大小、带电性质等对其进行分离与纯化。根据需纯化蛋白的特性可以选择不同的纯化方法，以提高纯化蛋白的质量。^[4]

研究方法与实验方案：

1. 获得cDNA片段

提取灵芝RNA，反转录得到cDNA。设计引物，PCR扩增目标片段，电泳检测后将扩增成功的片段进行胶回收并连接T载体转化到DH5α感受态中，菌落PCR验证成功后进行测序验证。

2. 构建表达载体

测序验证成功后，对连T载体的目标片段和空载的表达载体进行酶切，酶切成功后，用DNA连接酶连接目标片段和表达载体。将连接好的表达载体转化到DH5α感受态中，用带有相应抗性的平板进行筛选，挑选菌落PCR验证成功的单菌落，进行测序验证。

将验证成功的表达载体转化到Rosetta或BL21表达菌株中，扩大培养，在适宜条件下进行诱导表达，获得蛋白。

3. 纯化目标蛋白

采用镍柱亲和层析法和磁珠纯化法进行目标蛋白的纯化，对纯化的蛋白进行SDS电泳分析，并对纯化效果进行分析。

技术路线：