1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1课题意义：
1.1.1百菌清的农业作用 百菌清（四氯间苯二腈）是一种广谱的氯代苯芳香族化合物杀菌剂，在农业生产中已使用30年之久，是世界上使用最广泛的杀真菌剂之一[1]，百菌清对弱酸、弱碱及光热稳定，在强碱介质中分解，无腐蚀作用。百菌清对如水稻、蔬菜、果树、茶叶等作物的真菌病害（包括番茄早疫病、叶霉病、斑枯病、瓜类霜霉病、茶炭疽病、橘子疮痂病等）具有高效的杀菌预防作用。其主要作用机理是其能破坏真菌细胞中的三磷酸甘油醛脱氢酶的活性，破坏真菌细胞的新陈代谢导致真菌失去生命力，从而达到预防作物真菌病害的作用[2]。
1.1.2百菌清的农业残留及危害 百菌清在环境中较稳定、残效期长，且具有明显的蓄积毒性。百菌清的黏着性十分良好，喷洒使用后，能够在体表附着从而不易被雨水冲刷掉，且半衰期较长（0-3个月），因此百菌清在农产品中的残留问题越发突出，引起人们广泛的关注[3]。百菌清的广泛使用及难降解特性给食品安全、人类健康和环境安全构成巨大威胁，尤其是因蔬菜水果上农药残留超标而可能引起的健康问题越来越受到人们的重视。
1.1.3百菌清的微生物降解 本课题组前面的研究工作已经筛选出了一株百菌清高效降解菌株得到了百菌清降解基因，并成功将百菌清水解脱氯酶（chd）基因克隆整合到枯草芽孢杆菌基因工程菌株染色体上，使chd基因在枯草芽孢杆菌上单拷贝和多拷贝表达。本研究在此基础上通过对chd基因启动子和信号肽等元件的优化，并将优化后的chd基因多拷贝整合到枯草芽孢杆菌基因工程菌株wb800染色体上，实现百菌清水解脱氯酶（chd）基因在枯草杆菌wb800中的高效胞外分泌表达，并进一步提高酶产量。从而可以应用到生产实践当中。
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标
通过实验修饰优化chd基因的启动子、信号肽等元件，然后使修饰优化后的百菌清水解脱氯酶（chd）基因在枯草芽孢杆菌染色体wb800上单拷贝和多拷贝整合并高效表达。随后测量比较三种拷贝数的百菌清水解脱氯酶表达量，得到百菌清水解脱氯酶高表达率的菌株和百菌清水解脱氯酶粗提液。并进一步探究其农药降解效果、对蔬菜的其他影响和贮藏时间对酶活性的影响。为百菌清的微生物降解方面的研究提供参考资料，并在解决瓜果蔬菜中百菌清农药残留超标污染具有一定的应用前景。
2.2研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
构建含有chd基因，并对chd基因的启动子、信号肽进行优化修饰，然后将扩增的chd基因（含启动子、信号肽、终止子并在末端加入抗性基因）序列单拷贝和多拷贝整合到枯草芽孢杆菌wb800染色体上，并通过抗生素平板涂布筛选出可以高效分解百菌清的菌株，并进行液态发酵，测量百菌清水解脱氯酶（chd）产量，然后比较三种拷贝数菌株的酶产量。然后进一步提取粗酶液用来制备降解制剂和固体制剂，分别用来喷洒黄瓜和在时间梯度内酶活性的测定，以得出测量农药降解效果、对蔬菜的其他影响和贮藏时间对酶活性的影响。
3.2技术路线：
4. 研究创新点
此前，有实验室将chd基因成功整合到大肠杆菌中并高效表达出来，本实验室采用的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为革兰氏阳性细菌，为典型好氧菌，是一种重要的原核表达宿主。枯草芽孢杆菌是转基因技术常用宿主菌之一，又是表达外源蛋白的工具。目前，枯草芽孢杆菌作为基因工程菌，可表达出近200种不同来源的蛋白基因。因枯草芽孢杆菌具有培养简单快速、发酵性良好、蛋白产量高、种类众多、发酵周期较短等优点，在工业生产、医药、生物防治、微生物添加剂、水产养殖、动物育种和农作物病虫害防治中发挥着越来越重要的作用。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌具有培养简单快速、良好的发酵性、产酶量高、种类多、发酵周期短、安全性好、环保等优点。
本课题目标成功将chd基因在枯草芽孢杆菌染色体上多拷贝整合并高效表达。本课题chd基因的构建，是采用pcr技术连接转录终止子、以及枯草杆菌apre的启动子和信号肽的百菌清水解脱氯酶（chd）基因片段，并在序列末端加入三种不同的抗性基因，得到三种目的基因片段。然后将携带有百菌清水解脱氯酶（chd）基因的片段整合到枯草芽孢杆菌wb800染色体上，得到单拷贝菌株；随后将含有另一种抗性基因的chd基因整合到单拷贝菌株的染色体上，得到两拷贝菌株；最后将含有第三种抗性基因的chd基因整合到两拷贝菌株的染色体上，得到三拷贝菌株。本次实验将chd基因多拷贝整合到枯草芽孢杆菌染色体上面，使chd基因可以稳定遗传和表达。
此外本课题还对chd基因启动子、信号肽加工优化。选用功能更强、表达效率更高的枯草杆菌apre的启动子和信号肽作为chd基因的启动子和信号肽，并整合到枯草芽孢杆菌wb800染色体，从而明显提高chd基因在枯草芽孢杆菌中的表达分泌水平，进一步提高菌株在一个周期内的酶产量。
5. 研究计划与进展
5.1研究计划：
2017年9月 查阅课题相关资料，阅读课题相关文献，对实验进行设计。
2017年10月-2017年12月 构建chd基因，并对chd基因的启动子、信号肽优化修饰。随后将修饰优化后的chd基因（含启动子、信号肽、终止子并在末端加入抗性基因）序列单拷贝整合到枯草芽孢杆菌wb800上，然后进行培养，通过抗生素平板涂布筛选出可以高效分解百菌清的菌株，并进行液态发酵，测量百菌清水解脱氯酶（chd）产量。
