1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义:细胞自噬是真核细胞内高度保守的细胞内物质降解过程，参与细胞中的物质代谢，维持细胞稳态。
细胞自噬对于细胞死亡和肿瘤抑制、神经退行性变、衰老、炎症、免疫和基因组稳定性等具有重要作用[1-2]。
饥饿等条件诱导细胞内双层自噬前体膜形成、延伸、闭合成成熟自噬体，之后与液泡融合后利用水解酶降解自噬体及其内含物。
2. 研究的基本内容和问题
1研究的目标：揭示escrt-0上的亚基vps27 对atg蛋白在成熟过程中脱落的影响，从而探讨vps27 是否参与自噬体封口。
2研究的内容：(1)获取hyg抗性基因的pcr产物为敲除vps27做准备。
(2)获取vps27敲除的酵母菌株，为探究vps27缺失对自噬体上atg蛋白在成熟过程中脱落的影响提供材料。
3. 研究的方法与方案
技术路线①获取hyg抗性基因的pcr产物②电泳检测③ 回收纯化④vps27基因敲除 ⑤ pcr扩增检测是否敲除成功 ⑥饥饿自噬诱导⑦荧光观察检测atg蛋白在atg8标记的自噬体上的定位情况。
研究方法及实验方案获取vps27基因敲除酵母菌(1)实验流程:a)从-70℃冰箱中找出待敲除菌株，划线于ypd平板上，26℃培养3天;b)挑取单菌落于2 ml液体ypd中，26℃，50 rpm旋转过夜培养;c)转接50μl 过夜培养的菌液到3 ml液体ypd, 26 ℃, 50 rpm旋转培养约7h至对数中期;d)取1 ml菌液，4,000 rpm，室温离心3 min，去尽上清;e)加入1 ml无菌水，涡旋重悬，4,000 rpm，室温离心3 min，去尽上清;f)加入120μl 50% peg, 18μl 1 m liac，涡旋重悬;g)加入10μl ssdna(已煮沸10 min，若敲除效率低，可适当增加)，32 μl 含有抗性基因的pcr产物，涡旋混合;h) 30℃，温育30 min;i ) 42℃，热击30 min;j ) 4,000 rpm，室温离心3 min，去尽上清;k)加入1 ml液体ypd,锅旋重悬，加到含有2 ml液体ypd的试管中，26 ℃过夜培养;l)取1.5 ml过夜菌液，4,000 rpm，室温离心3 min，去掉大部分上清，涡旋重悬，涂布于相应筛选平板上，26℃培养3天;m)挑取单菌落于2 ml液体ypd中，26℃过夜培养;n)提取基因组dna，做诊断pcr以验证目标基因是否成功敲除。
荧光观察atg蛋白在atg8标记的自噬体上的定位情况 荧光显微镜技术是目前细胞生物学研究的一种常规技术，因此也是研究细胞自噬的常用技术，操作步骤如下:(1)挑取平板上目标菌株的单菌落到相应的液体培养基中，26℃过夜旋转培养(应选择大小适中的菌落，但只挑取菌落的一小部分，使过夜培养后的菌液浓度在对数期内(od600约0.4~1.0) );(2)转接适量的菌液至相应的液体培养基(最终培养液体积约5 ml)中，26℃，200 rpm振荡培养6h至对数中期(od6oo约0.40.6 )(可用分光光度计测定过夜培养菌液的od6oo以确定转接菌液的量，使培养6h后可达到对数中期(代时2 h));(3)诱导细胞自噬:4,000 rpm，室温离心3 min收集菌体，无菌水洗一次后加入3 mlsd-n(使菌液浓度约1 od6oo )，重悬后倒入新的无菌三角瓶中，26 0c } 200 rpm振荡培养2 h;(4)制备样品:取1.5 ml左右菌液，10,000 rpm，室温离心1 min，去掉大部分上清，涡旋重悬菌体，取3 μl 菌悬液到载玻片上，盖上载玻片;(5)荧光观察:选取合适的曝光时间，用蓝色滤光片观察gfp，绿色滤光片观察rfp，在油镜下观察荧光并拍照。
4. 研究创新点
目前的研究大量集中在自噬膜的延伸调控，但是这个过程中，自噬体的闭合也十分重要，其闭合与否是自噬体能否成功与溶酶体融合以及对货物降解的关键调节步骤。
然而目前很少有人知道调节自噬体闭合的机制。
该课题探讨的是escrt-0上的亚基vps27缺失对自噬体上atg蛋白在成熟过程中脱落的影响，为自噬体闭合的调节机制的更深一步研究奠定了基础。
5. 研究计划与进展
（1）2018年11月初2016年12月初 试验阶段： 获取hyg基因的 pcr产物，构建好vps27和ypt7 敲出的菌株的三组酵母菌株。
（2）2016年12月初2016年1月初试验阶段： 饥饿诱导细胞自噬，预实验筛选获得荧光观察自噬观察最好的培养条件。
（3）2016年2月初2016年3月初 试验阶段： 荧光观察，通过检测atg蛋白在atg8标记的自噬体上的定位情况，可推断自噬体双层膜是否发生了封闭。
