拟南芥sasp1突变体对低氮的敏感性分析开题报告

1 本课题研究意义

1.1 枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理功能^[1]，它们通过对蛋白酶原的激活或抑制而起调节因子作用。枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin) 属丝氨酸蛋白水解酶类。枯草杆菌类蛋白酶(Subtilisin-like protease)广泛存在于细菌真菌和寄生虫等生物中。研究表明，类枯草杆菌蛋白酶与病原性细菌真菌的致病性相关，在真菌孢子形成过程中的蛋白质充分降解及细胞自噬过程等方面起非常重要的作用。由于类枯草杆菌蛋白酶是某些昆虫或寄生虫的病原真菌侵染宿主时产生的一种毒力因子，这种因子已显示出对某些致病真菌具有明显的杀虫增效作用，将来有望开发出致病真菌的生物杀虫增效剂^[2]。此外，对枯草杆菌蛋白酶进行体外溶栓实验，发现该酶在体外具有良好的溶栓效果，且不会造成红细胞的溶血现象 ^[3]。而且枯草杆菌类蛋白酶也与小麦叶片衰老有着密切的关系^[4]。

1.2 植物的氮素营养

氮素（N）是蛋白质的主要成分。在植物生命中占有首要地位，被称为生命元素。其含量大约占蛋白质总量的16-18%。它的功能有：（1）是细胞质、细胞核和酶的组成部分。因为它们都离不开蛋白质。（2）作为遗传物质的核酸，构成生物膜的磷脂和叶绿素等化合物中都含有氮。（3）组成某些植物激素、维生素和生物碱的成分。所以，氮是植物需要大量吸收的一个重要元素^[5]。

1．2．1 氨同化

植物根系对硝酸（NO₃^-）的吸收是N素同化的必要条件。植物一般吸收氨盐或硝酸盐等无机氮化合物，当硝酸（NO₃）还原为亚硝酸盐(NO₂)后，亚硝酸盐(NO₂)转为铵（NH₄ ），然后便用于植物生长和发育所需要的氨基酸和蛋白质的合成^[6]。一般来说，氨同化是植物氮代谢的重要一步。氨的同化方式为进入谷氨酸合成酶循环，主要作用的酶类有谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）^[7]。

1．2．2 氮素供应对植物根系的影响

氮素供应对植物根系的影响主要有四种效应：（1）局部供应硝酸盐对侧根(lateral root,LR)伸长的刺激效应；（2）植物组织中高浓度的硝酸盐对侧根分裂组织活动的抑制效应；（3）根际高C:N比对侧根发生的抑制效应；（4）根际L-谷氨酸对初生根生长的抑制效应和对根分枝的刺激效应。由于矿化速度的限制,土壤中的有效氮成为植物生长的主要限制因素。

1.3 枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶与氮素的关系

谷物中的最终氮含量取决于再活化过程的效率^[8]。当植物开始自然衰老，细胞分裂素介导的枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶被诱导表达，促进了植株中的氮素活化，从而提高了植物对氮素的利用率^[9]。

通过研究枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶在拟南芥根系中对氮素的响应，我们可以发现氮素胁迫下植物生理生化的变化，从而进一步研究如何提高氮素同化能力和提高氮素利用效率。

2 国内外研究概况

2.1 枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶的研究现状

本实验室博士刘少伟等从小麦暗诱导衰老的叶片中分离纯化了一种与叶片衰老相关的类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶，命名为TaSSP1（Triticum aestivum Subtilisin-like proteases1）并通过质谱鉴定所得数据在数据库中比对，获得了该蛋白酶氨基酸序列的部分信息。并研究根据已知的该蛋白酸氨基酸部分序列，釆用的方法得到了小麦的该蛋白酶基因全长序列。TaSSP1基因CDS区全长2361bp，编码786个氨基酸，在丝氨酸蛋白酶家族中属于S8A家族。对TaSSP1蛋白结构进行生物信息学分析，该蛋白酶含有五个结构域，分别为N端信号肽、I9 Inhibitor区域、PA ( Protease-associated)结构域、催化结构域和C端延长区域。

而后陈颖等在上述研究基础上，首先对去除信号肽的全基因序列以及其不同结构域的基因序列进行了原核表达，获得该蛋白酶的不同蛋白片段，然后通过活性分析等研究，阐明该蛋白酶激活的机制。其次，分别从蛋白和核酸水平对小麦体内该蛋白酶的表达情况进行分析鉴定，进一步明确该蛋白酶的生理功能。研究发现，在小麦生长过程中，随着植物体的成熟，TaSSP1会有增加的趋势，表现为用ABA对小麦进行整株处理，TaSSP1在RNA水平以及蛋白水平上的表达量都有逐渐增加的趋势；而用6-BA对小麦进行整株处理，TaSSP1在RNA水平以及蛋白水平上的表达量都有逐渐增加的趋势。当对小麦叶片进行离体暗处理时，叶片则迅速的进入了衰老状态，就表现出78KD的TaSSP1会降解为分子量分别约为71KD、66KD、57KD的片段；同时伴随着叶片内Rubisco的量的逐渐减少，其中，分子量为71KD、66KD的TaSSP1片段具有活性，而分子量为57KD的片段并不表现活性。所以认为TaSSP1是与小麦生长以及衰老密切相关的蛋白酶。

2.2 枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶与植物氮素营养的关系

叶片中氮的主要储备是质体蛋白，占叶肉细胞中总氮含量的75％^[10]。在叶片衰老期间，这些质体蛋白（主要是 Rubisco）的降解为活化提供了可用的氮。虽然已经报 道了几种衰老相关蛋白酶的诱导^[11]，但是它们在衰老期间在蛋白质分解中的作用仍然不清楚，Rubisco降解的机制也是如此^[12]。通过对成熟小麦籽粒灌浆过程的研究，归纳出两种枯草杆菌蛋白酶（P1和P2)对幼嫩植物在压力诱导的衰老过程的作用。对小麦叶鞘的提取液进行western blot分析，结果显示在植物的生长周期中（植物开花期的后9天）很晚才出现P1，P1出现7天后与植物开花期的最初值相比上升了2.5个指数倍。另一方面， P2 的信号在植物开花期之前就可以检测到并且在开花期之后迅速增长，籽粒灌浆期结束时与之前相比增长了4个指数倍。P1与P2的含量与叶鞘中rubisco大小亚基的降解以及叶耳中氮素积累有关。在这个过程中同时检测到叶片中IP和IPA（两种具有CTK-细胞分裂素活性的腺嘌呤衍生物）含量的降低。离体叶片在黑暗中开始衰老的过程中，两种蛋白酶的含量受6-BA(也是一种具有CTK-细胞分裂素活性的腺嘌呤衍生物）添加的影响，P1被完全抑制，P2含量被降低。

3 应用前景

通过研究，探索枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶在氮素营养中的作用，有利于氮素的高效利用，这对实施节能化与节约化栽培具有一定的理论指导意义。

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