马铃薯SpHsfa4c基因的表达模式分析与表达载体构建开题报告

1 本课题研究意义

植物在生长和发育过程中会受到各种非生物因子的胁迫，其中温度对植物生长发育的影响尤其严重。近年来，随着全球温室效应的加剧、气温的上升，植物正面临着高温的胁迫^[1]。众所周知，植物在生长发育的各个时期都要求有一定的适宜温度范围，尤其在开花、结果等发育期内对温度最为敏感^[2]

马铃薯（Solanum tuberosum），茄科茄属，一年生草本植物。马铃薯性喜冷凉，是喜欢低温的作物。对温度的要求非常严格，块茎生长的适温是16℃~18℃，当地温高于25℃时，块茎停止生长；茎叶生长的适温是15℃~25℃，超过29℃停止生长。研究热激相关基因的表达模式和表达载体的构建对我们了解耐热基因具有重要的意义。

2 国内外研究概况

植物在长期的进化过程中形成了各种机制使其在温度升高的情况下得以生存。包括遗传机制、形态适应、短期的逃避机制（例如改变叶片方向和蒸腾作用等）、细胞生理反应等。

近年来的研究揭示了压力信号转导途径的关键组分，这些组分能增强植物对温度的耐受性。大致可分为3 条主要途径: 其一，高温导致胞质内蛋白质变性，变性的蛋白质聚集，进而引起热激蛋白和热激转录因子的积累，热激蛋白使变性的蛋白质复性，具有分子伴侣的功能，有助于高温下保持和恢复蛋白质的活性结构。其中HSP70 与抗热性的关系最为突出。热激转录因子进入细胞核与热激元件结合，诱导热激基因的表达;其二，热胁迫引起活性氧类物质的生成，由此激发活性氧类物质介导的信号传导途径通过某种未知途径将信号传至细胞核内，同热激基因的其他元件相结合，诱导热激基因的表达^［3］; 其三，高温导致植物细胞膜系统流动性加强和细胞骨架的重组，造成胞外钙离子的涌入，而钙离子的变化激活钙依赖蛋白激酶( CDPKcalcium-dependent protein kinase) 的活性，进一步诱导了促分裂素原活化蛋白激酶( MAPKmitogen-activated protein kinases) ，再将信号传递到细胞核，诱导热激基因的表达。其次一些植物激素、渗透调节物质、光合作用与蒸腾作用、细胞膜热稳定性以及其它耐热机制等方面目前都有研究^[1]。

在植物耐热的信号传导过程中，转录因子是一个关键因素。在胁迫反应中，它们不断合成并将信号传递和放大调控下游基因的表达从而引起植物的一系列抗逆反应。热激转录因子（Heat Shock transcription factor，HSF）是存在于细胞内在热胁迫下可以激活热激基因表达的一类转录调节蛋白，是高等植物转录水平上热胁迫响应基因的中心调控因子，在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中起着不可替代的作用^[4]。自1987年首先克隆出果蝇HSF基因序列以来，在酵母、拟南芥、玉米、番茄、水稻等生物体中均克隆到HSFs^[5-7]。目前，在植物中已经发现了20多种HSFs。

典型的热激转录因子首先包括N端的DNA结合域(DBD)(螺旋－转角－螺旋)基序。与其相邻的是寡聚化结构域（OD）（疏水氨基酸残基组成的双边七价构型HR-A/B域）。其次为核定位信号(NLS)、核输出信号(NES)和C端的激活域(CTAD，AHA基序)^[22]。其中，DBD结构域主要负责HSFs识别热激元件(Heat Shock Element，HSE)，并与其正确结合，C端激活域的大小和序列是最不保守的，该区域主要负责HSFs与基础转录复合体进行结合。在非逆境条件下，HSF以无活性的单体形式存在于细胞质中，细胞遭遇高温胁迫后相互结合形成有活性的三聚体进入细胞核，并通过与下游基因启动子区的HSE结合启动下游基因的表达^[8]。HSE在真核生物中的共有序列(核心重复单位)为5'-nGAAn-3' ^[9]。而植物中，最适的HSE共有序列为5'-aGAAg-3'。HSE是HSF蛋白结合位点，DNA上至少存在2～3个HSE的核心重复单位，HSF三聚体才能有效结合^[10-12]。

植物中热激转录因子的种类和复杂程度比其它生物高。根据结构的不同可以将他们分为HSFA、HSFB和HSFC三类，其中HSFB类HR-A/B结构域中A和B结构域间只有7个氨基酸残基但是除了这7个氨基酸A和C类中还分别有21个和7个氨基酸的插入。此外B类和C类不包含C端的AHA型激活结构域^[13]。目前，HSF基因在拟南芥、酵母菌、烟草、番茄等生物中都有所研究。拟南芥基因组测序完成后，Nover等^[13]根据热激因子保守的DNA结合域和相邻的HR-A/B区域共鉴定出21个拟南芥HSF家族成员，包括15个HSFA1、5个HSFB和1个HSFC。番茄是最早开展HSF基因研究的植物早在20世纪90年代，Scharf等^[14] 就从番茄cDNA文库中筛选到3个可以与HSE结合的HSF，包括LpHsf8、LpHsf24和LpHsf30，其中LpHsf8为组成型表达，而LpHsf24和LpHsf30为热胁迫诱导基因。

研究表明，HsfA4响应于氧化还原胁迫，具有调节基因表达的功能^[14] ，在转基因拟南芥植物中，反义抑制 HsfA4a基因，编码APX1和Zat12的转录物的积累被抑制了，导致这些功能的分子机制并不清楚^[15]。

在马铃薯研究方面，本实验室对栽培种马铃薯 （Solanumm tuberosum ）热激转录因子进行了系统的研究，鉴定得到27热激转录因子，并根据他们的结构和病理学特征，通过生物信息学和病理进化分析将这27种热激转录因子分为为A，B和C组。发现同一类中的StHsf有着相似的基因结构和保守基序。启动子和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测StHsfs的表达量，表明这些基因响应于各种胁迫，其中StHsfa4c，StHsf30，StHsfa5，StHsfa8和StHsf24在非胁迫条件下属于组成型表达,在热激处理开始的短时间内表达量迅速上升，从而调控热激蛋白的表达，进而使植物抵抗热激损害^[16]。但是Hsfa4c基因的表达模式和表达载体构建方面还没人研究。

3 应用前景

在我国南方地区，夏季普遍高温，严重限制了马铃薯的生长，在六月份，基本停止生长，这对马铃薯的产量造成严重影响。

Solanum pinnatisectum是一个比栽培种马铃薯具有更强耐热能力的野生型马铃薯。研究SpHsfa4c基因的功能，可以为培育耐热性马铃薯提供候选基因。

参考文献：

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研究方法：

这次实验的表达模式分析采取QRT-PCR分析以及分子生物学工具。

载体构建时采用了植物总RNA的提取与纯化，质粒DNA的提取与纯化，大肠杆菌感受态的制备及转化，重组DNA分子的构建，PCR基因扩增等研究方法。

技术路线：

空间表达模式分析（不同组织）

目的基因表达模式分析 时间表达模式分析（不同生长时期）

诱导表达模式分析（热处理）

过表达载体构建

表达载体构建

反义表达载体构建

实验方案

1马铃薯SpHsfa4c基因的表达模式分析

（1）野生马铃薯空间表达模式分析

选取了马铃薯(Solanum pinnatisectum )野生品种E，由本实验室保存，2017年 3 月将带有芽眼的块茎切块种于大棚内，同田间管理，在马铃薯花期分别取马铃薯的根、茎、叶、花、顶芽和花芽，液氮速冻后，-70℃ 保存，用于不同组织中表达分析。在马铃薯采收期分别取马铃薯的匍匐茎、延伸匍匐茎、膨大匍匐茎、初始块茎和成熟块茎样品，液氮速冻后，-70℃ 保存，用于块茎形成过程中的基因表达分析。

利用半定量RT-PCR方法检测各组织中的表达量

（2）野生马铃薯时间表达模式分析

选取了马铃薯(Solanum pinnatisectum )野生品种E，由本实验室保存，2017年 3 月将带有芽眼的块茎切块种于大棚内，同田间管理，在马铃薯芽期，苗期，花期，结薯期分别取马铃薯的不同组织，液氮速冻后，-70℃ 保存，用于不同组织中表达分析。利用半定量RT-PCR方法检测各组织中的表达量。

(3)野生马铃薯诱导表达模式分析

将野生马铃薯试管苗放置到37℃下热激处理0h,0.5h,2h,6h,12h,24h后，利用半定量RT-PCR方法检测各时间段中根茎叶的表达量。

2马铃薯SpHsfa4c基因表达载体的构建

（1）SpHsfa4c 反义抑制载体的构建

将 SpHsfa4c 基因部分反义片段部分插入到表达载体 pCMBIA1306的 CaMV35S 启动子和 NOS 终止子之间。分别设计引物S ( 5'-CTTCCATGGCTTC CTCCGGTTGAGAAG-3' ) 和引物 A (5'-GAAGGATCCTTTGACGGCGAAGCTA

T-3' )，下划线分别为 Nco I 和 BamH I酶切位点序列，以马铃薯 cDNA 为模板，反应体系为：2.5 l 10PCR buffer，2 l MgCl₂ ( 25 mM ), 2 l dNTP ( 2.5 mM )，10M正反向引物各1 l，0.25 l Taq 酶( 5 U/l )，用水补足至 25 l。PCR 条件为：94℃ 预变性 5 min，然后 94℃ 40 s；52℃ 40 s；72℃ 40 s，进行 30 个循环，最后 72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物，进行 Nco I 和 BamH I 双酶切，向酶切反应体系中加 1/10 体积的 3 M 醋酸钠( pH5.2 )和 2 倍体积的无水乙醇，-20℃ 保存1 h后，4℃ 10000 rpm离心10 min，去上清，沉淀自然风干，用水溶解；同时，将提取 pCMBIA1306载体 37℃ 进行 Nco I 和BamH I双酶切 5 h后，电泳回收pCMBIA1306 载体大片段，此即为带有 Nco I 和BamH I 酶切位点粘性末端的质粒，可以用于连接；将上述两种双酶切产物按照摩尔比为 3～10：1混合，在 T4 DNA 连接酶作用下 16℃ 连接 12 h，连接产物直接用于对转化感受态大肠杆菌 DH5α，PCR检测抗生素抗性

单克隆，扩大培养阳性单克隆，提取重组质粒，经测序验证后命名为pCMBIA1306- FSpHsfa4c 。

SpHsfa4c过表达载体的构建

将 SpHsfa4c 基因插入到 pCMBIA1306表达载体 CaMV35S 启动子和 NOS 终止子之间。分别设计引物 S ( 5'-TATCCAATGGCTTCCAAAATG

TGTGAACC-3' ) 和引物 A( 5'-TATAGATCTATCATCAACGCCTTCTACCGGC

AGT-3' )，下划线分别为 Nco I 和 Bgl II 酶切位点序列。以马铃薯 cDNA 为模板，反应体系为：2.5 l 10PCR buffer，2 l MgCl₂ ( 25 mM )，2 l dNTP ( 2.0 mM )，10 M正反向引物各1 l，0.25 l Taq酶( 5 U/l )，用水补至 25 l。PCR 扩增条件为：94℃预变性 5 min，然后 94℃ 变性 40 s；60℃ 退火 40 s；72℃ 延伸 40 s，进行 30 个循环，最后 72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物，在 37℃ 进行 Nco I 和 Bgl II 双酶切 5 h 后，向酶切反应体系中加 1/10 体积的 3 M 醋酸钠( pH5.2 )和 2 倍体积无水乙醇，-20℃ 保存 1 h 后，4℃ 10000 rpm 离心 10 min，去上清，沉淀自然风干，用水溶解；同时，将提取pCMBIA1306载体 37℃ 进行 Nco I 和 Bgl II 双酶切 5 h 后，电泳回收pCMBIA1306 载体大片段，此即为带有 Nco I 和 Bgl II 酶切位点粘性末端的质粒，可以用于连接；将上述两种酶切产物按照 3～10：1 摩尔比混合，在 T4 DNA 连接酶的作用下 16℃ 连接 12 h，连接产物直接用于对转化感受态大肠杆菌 DH5α，PCR 检测抗生素抗性单克隆，扩大培养阳性单克隆，提取重组质粒，经测序验证后命名为 pCMBIA1306- SpHsfa4c 。

可行性分析：

（1） 根据本实验室前人研究发现Hsfa4c基因明显受热激诱导，并且野生马铃薯是一种比栽培马铃薯更具耐热性的品种，在理论上本实验可行。

（2） 本实验室关于RT-PCR，QRT-PCR，植物总RNA的提取与纯化，质粒DNA的提取与纯化，大肠杆菌感受态的制备及转化，重组DNA分子的构建，PCR基因扩增等研究技术比较成熟，在实验技术方面本实验可行。

（3） 本人本科期间已近学习分子生物学理论知识及基础实验技术操作，本实验室师兄师姐耐心教导，在个人能力方面本实验可行。