1. 研究目的与意义
大豆疫霉病菌引起的大豆疫病，在大豆的各个生长发育期均可侵染和危害，引起寄主根、茎、枝和种子腐烂，严重时造成绝产，是大豆生产中的毁灭性病害之一，是我国对外公布的I类植物检疫危险性病原真菌。目前世界上的主要大豆输出国，如美国、巴西、阿根廷等，均有大豆疫病的发生和分布，且在输出的商品大豆中经常夹带一定量的土壤。长期以来, 在我国尚未分离到大豆疫霉病菌，这可能是由于分离技术等方面的原因。大豆疫霉病是我国对外重要检疫对象之一，由于技术上的原因, 在快速准确鉴定该病原菌方面有一定的困难[1]。为防止该病菌传入我国，在进境植物检疫时，快速灵敏的检疫鉴定大豆疫霉病菌的技术的发展迫在眉睫。
目前对大豆疫霉病菌的检测方法有叶碟诱集与形态学鉴定法、常规PCR、实时荧光PCR、序列测定与比对、ITS 分子检测技术[2]等多种方法，引起了一定程度的混乱与不便[3]。叶碟诱集与形态学鉴定法等传统的病原菌检测和诊断过程中存在周期长、工作量大、结果不准确等缺点。随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点。生命的遗传信息存储于DNA序列之中,基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。目前已发展出的DNA标记技术不下十几种[4],DNA分子标记的建立和迅速发展给植物病原菌分类鉴定、检测和病害诊断研究开辟了新的领域。因此，利用分子检测技术规范大豆疫霉病菌的快速准确检疫鉴定方法，防止该病菌的传入，保护我国农业生产安全具有重要意义。
2. 国内外研究现状分析
大豆疫霉菌的卵孢子主要通过带病种子或者粘附在种子里的土壤颗粒进行传播。对于此菌，目前已有较为清楚的认识，我国出入境检验检疫行业标准sn/t1131-2002对大豆夹带土壤中大豆疫霉病菌的检测和鉴定，仍采用的是叶碟诱捕法，该方法所需周期长达14天，灵敏度低，不能适应口岸快速检测的要求，对带病种子的检验，目前国内外研究报道甚少，主要通过显微镜检验的方法，但由于大豆种子上还携带大豆霜霉病菌，并且两者的卵孢子形态十分相似，所以容易出现错误的鉴定结果。
随着分子生物学技术的发展，以pcr技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，这类方法具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点。所以也引起了广泛的研究并开始运用于各种菌类的研究。王颖等人将特异引物psypt3f／psypt2r与荧光染料sybrgreen结合，成功建立了大豆疫霉菌的实时pcr检测方法，由于ypt1基因是单拷贝存在，在进行定量检测量时比用its序列作为靶标更准确[5]。三重pcr分子检测也已被用于两种检疫性疫霉菌柑橘冬生疫霉和丁香疫霉[6]的同步特异检测，在稻曲病菌[7]和大豆疫霉菌[8]等方面均开展了pcr检测相关技术。目前已有相关报道，利用scar （sequeneed charaeteriezd amplified region，序列特征扩增区域）分子检测技术来鉴定许多病原真菌、卵菌、细菌和线虫。例如，李玥莹等人[9]根据差异谱带的碱基排列顺序设计特异性引物，然后进行序列扩增，成功将rapd分子标记转化为scar分子标记，并将该标记命名为s405-320，从而开发了高粱抗丝黑穗病菌的scar检测标记；李强等[10]对于感染中四小麦条锈菌t4菌采用rapd技术，通过揭示小麦条锈菌生理小种间及生理小种内的遗传多样性，寻找主要流行小种的特异性分子标记，从而为建立具有实用价值的中国小麦条锈菌生理小种的快速分子检测体系奠定基础。国内外也有许多关于scar技术在小麦根腐菌、烟草疫病菌、旋柄腐霉等几十种病原菌检测方面的应用[11-12]由于scar可以在整个基因组中检测多态性，由此可通过此方法开发出一些检测大豆疫霉的新的分子靶标。本研究对检测大豆疫霉rapd反应体系进行了优化，在此基础上，对大豆疫霉进行rapd鉴定，将rapd标记转换为scar标记，以期用于从其它疫霉属物种和侵染大豆的土传病原菌快速鉴定出大豆疫霉，以便为我国的大豆疫霉检验检疫提供理论基础和技术方法。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容
本研究对检测大豆疫霉rapd反应体系进行了优化，在此基础上，对大豆疫霉进行rapd鉴定，将rapd标记转换为scar标记，以期用于从其它疫霉属物种和侵染大豆的土传病原菌快速鉴定出大豆疫霉，以便为我国的大豆疫霉检验检疫提供理论基础和技术方法。
研究计划
4. 研究创新点
本研究中所采用的SCAR（Sequeneed Charaeteriezd Amplified Region，序列特征扩增区域）分子检测技术是由Paran和Michelmore在1993年提出的一种新型分子标记，属于位点特异的PCR标记方法，此标记兼具RFLP和RAPD的优点，其检测基因DNA多态性的区域几乎覆盖整个基因组，然后把目标RAPD片段进行克隆、测序，并以此与全基因组比对推测出其前后14个核苷酸，根据原RAPD片段两端的序列设计一对引物，通常为24个碱基，它包括原来RAPD分析所用的10个碱基和RAPD标记前后的14个碱基。然后以这一对长引物进PCR特异扩增，这样就与原来的RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，这样的位点就称为SCAR。这样既保持了原分子标记的鉴定功能，又获得了常规PCR稳定、可靠的特点。本研究对检测大豆疫霉RAPD反应体系进行了优化，在此基础上，对大豆疫霉进行RAPD鉴定，将RAPD标记转换为SCAR标记，以期用于从其它疫霉属物种和侵染大豆的土传病原菌快速鉴定出大豆疫霉，以便为我国的大豆疫霉检验检疫提供理论基础和技术方法。
