枯草芽孢杆菌表达系统产酶条件的优化开题报告

全文总字数：6758字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究背景及意义：

（一）枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）是一种非常有前景的用于各种生物分子的生产系统^[1]。其具有强大的蛋白质分泌能力的优势,并且发酵条件简单,因而被广泛应用于工业和食品酶制剂的生产中^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

本实验以am 1基因为例，在枯草芽孢杆菌中实现异源表达。通过单因素试验，对α-淀粉酶摇瓶发酵条件的优化，以得出发酵α-淀粉酶的最适碳源,最适氮源,最适温度，最适初始ph值，以及金属离子和添加剂对发酵的影响，再通过α-淀粉酶的发酵罐发酵优化，扩大整个表达系统，得出溶氧，初始ph值等最适发酵条件，以及补料对发酵的影响。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1 种子液的制备

挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中，37 ℃条件下在摇床中180 r/min振荡培养12h。

2 摇瓶中发酵条件优化

2.1最佳温度的测定

采用发酵培养基，液体种子液以2%接种量接入装有 100 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中，分别在37 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃条件下，各组3瓶，180 r/min 摇床培养12 h，取样测定酶活，确定最佳发酵温度。

2.2最佳生长初始pH值的测定

采用发酵培养基，发酵培养基初始pH 分别调至 6.8、7.0、7.5，种子液以2%接种量接入装有 100 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中，各组3瓶，180 r/min 摇床培养12 h，取样测定酶活，确定最佳发酵温度。

2.3添加金属离子对发酵的影响

3瓶发酵培养基中分别添加0.2%的CaCl₂，另一瓶不额外添加金属离子的培养基做对照，种子液以2%接种量接入装有 100 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中，180 r/min 摇床培养12 h，取样测定酶活，确定Ca² 促进还是抑制枯草芽孢杆菌的发酵。

3 发酵罐中发酵条件的优化

3.1最佳生长初始pH值的测定

改变发酵罐中发酵液的初始pH值，调整为6.8、7.0、自然pH，发酵过程中,温度维持37 ℃，分别进行三次发酵，从发酵起始，每隔2-3 h 取发酵液测定酶活，得出最佳初始pH。

3.2 补料对发酵的影响

不进行补料发酵时，发酵过程中,温度维持37 ℃,pH值维持在7.0~7.5 (pH值通过滴加40% H₃PO₄或者5 mol/L KOH来维持)；再进行补料策略发酵，取样测定，对比酶活是否提高。

4 α-淀粉酶活性检测

4.1 稀释酶液（稀释600倍）

取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，1000 rpm 离心 2 min，取上清液100 μl于新的1.5 ml离心管中，再加入500μl Tris-HCl，混匀；取出100 μl于新的1.5 ml离心管中，再加入900μl Tris-HCl，混匀；再取出100 μl于新的1.5 ml离心管中，加入900 μlTris-HCl；取出100 μl 稀释后的酶液。

4.2 α-淀粉酶性质检测

采用DNS法。酶活定义:在测定的pH和温度条件下,水解1%可溶性淀粉,每分钟产生1 μmol还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

将取出的100 μl稀释液加入提前加有2ml含5%淀粉的50 mMTris-HCl 的5 ml离心管中，缓冲液作为对照组，于50 ℃水浴中反应10 min，再加入2 mlDNS试剂，于沸水中反应5 min，冷水中冷却，在540nm波长下测定。

在选定波长处(540 nm),用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,系列标准溶液浓度为横坐标作图，得出标准曲线：y=0.2455x 0.0632。

酶活计算：

可行性分析：

（1）Bacillus subtilis作为工业上最常用的异源蛋白生产菌株,具有遗传可操作性,并且它的基因组均已完成了全测序。更为重要的是,该微生物可以进行成本低廉的、较容易的大规模发酵。某些同源蛋白在B.subtilis中的分泌量甚至可以达到克/升的级别,所以其十分适合作为蛋白表达分泌的"细胞工厂"。

（2）国内外对枯草芽孢杆菌表达系统产酶条件的优化已有众多研究，可加以借鉴。

（3）前期通过学习，已基本学会了发酵罐的操作以及α-淀粉酶性质测定方法，实验按序进行。

4. 研究创新点

枯草芽孢杆菌作为表达系统发酵时，国内外众多学者已经对发酵培养基和发酵条件的研究以及优化进行了大量试验，并得出了结果，但是对枯草芽孢杆菌在发酵罐中发酵条件的优化研究较少，因为实验室中进行发酵罐发酵的结果不像工厂大型机器发酵那样容易控制。通过实验我们发现，当发酵罐条件设置适当且过程严格保证无杂菌，通过多次预实验以及反复实验，也能得出预期结果，进一步提高实验的准确性与可信度。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2018.09-2018.10 和指导老师确定毕业设计的实验内容以及题目

2018.10-2018.11 前往南京工业大学生物与制药工程学院学习发酵罐使用；