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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
随着人口增加，人类面临着气候变暖和能源危机的挑战，与此同时也面临食品安全方面的挑战则有必要从提高农产品的产量上满足人类粮食的需求。而植物病虫害是造成农作物减产的重要因素[1]。在所有的植物病害中，其中70-80%是由真菌侵染所致。在我们国家农作物生产防治中，大多数都是直接使用化学农药为主。因为化学试剂对植物病害可以很快速地产生理想的杀菌效果，但这对整个自然环境是起了一定的负作用，也一定程度上危害了植物自身以及周围的生态环境。正是因为化学杀菌剂的大批使用对生态环境、有益生物及人体所引致负作用越来越多，同时植物病原菌抗药性的增加，化学杀菌剂的作用效应下降，所以在近几年生物防治研究中很多科研工作者将目光转移到生物防治菌上[2]，木霉属真菌因其胞外丰富的真菌细胞壁裂解酶产生能力、高效的植物根际定殖和植物促生长能力被广泛用于植物土传真菌病害防控的研究中[3]。哈茨木霉（trichoderma harzianum）是木霉属中应用最广泛、效果最好的一类生防菌，又称真菌杀菌剂[4]。哈茨木霉菌能分泌产生一系列胞壁降解酶类，如几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶等[2]。但现阶段哈茨木霉水解酶的研究多集中于几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。这两种酶对病原真菌细胞壁的降解有重要作用，从而让抑制病原孢子萌发[3]。本课题的意义是通过基因工程的手段构建能高效地合成高活性的β-1,6-葡聚糖酶的哈茨木霉工程菌，获得并可以将其实际应用起来。
现阶段国内外研究木霉菌防治各种不同植物病原真菌的例子越来越多，但真正投入实际应用中还是缺少很多种可靠且有效的生物菌剂，不同环境中的生物防治对于木霉菌对生存环境也有一定的要求。故可以通过基因工程手段筛选出能够在逆境环境下生长的改良菌株或活性增强的菌株等。同时随着研究的推进，也有关于哈茨木霉真菌细胞壁水解酶在其他生产工艺中的应用。
生物防治不仅可以有效地也保护了植物表面很多有益菌的生防菌种，还可以解决使用化学农药的残留问题。因此利用木霉菌防治植物真菌病害, 在建立环保型生态农业,在农业可持续性发展战略上有着广阔的开发前景。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
构建产高活性β-1,6-葡聚糖酶的哈茨木霉工程菌
研究内容：
3. 研究的方法与方案
本项目拟采用的有关研究方法:
(1)ctab法提取真菌dna
提前准备摇好的菌液，取2ml菌液到离心管中，12000rpm，2min，去离子水洗2遍；加入500ul 5*ctab(含1%β-巯基乙醇），放入液氮中速冷30s，立即放入65℃水浴锅中30s，反复3次；加入1/3体积玻璃珠，在漩涡振荡器上交速振荡4~5min；65℃保温20min，每隔10min摇匀几次；加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24:1，v/v/v）12000rpm,10min；将上清液移入到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1，v/v）12000rpm,10min；加入500ul异戊醇静置20min-30min，12000rpm,10min；倒掉上清液，加入70%的乙醇200ul，洗沉淀，室温干燥；加入100ul te使dna完全溶解；加入rnasea(10mg/ml),65℃保温30min以上；重复前三个步骤，最后将dna溶入30ulddh2o中，放入-20摄氏度中保存。
4. 研究创新点
本课题的创新之处在于引入基因编辑技术以提高菌株筛选效率，其次在于比较双拷贝和随机突变之间的酶活差异。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2019.01 确定选题、撰写开题报告
2019.02~2019.03实验前期准备，构建相关载体等实验工作
