来源于粘细菌EGB中醛酮还原酶的克隆表达与酶学性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

醛酮还原酶在微生物的生理代谢与生长发育、人体内的醛酮转化与解毒过程中发挥着重要作用，尤其在生物催化制备手性醇方面表现出显著优势。

近年来，醛酮还原酶已成为抗逆转基因植物发育的合适候选物，包括干旱，镉，高温，霜冻，反应性醛以及甲基紫精和百草枯产生的氧化应激等[1]。

醛酮还原酶广泛分布于原核生物和真核生物。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标通过对粘细菌egb的基因组分析，发现其包括多个醛酮还原酶编码基因，本课题拟从粘细菌egb中鉴定所有假定的醛酮还原酶进行克隆表达，并对其进行酶学性质分析，探索其在生物催化领域的应用潜力及其在非生物胁迫耐受性的潜力。

2.研究内容（1）通过生物信息学分析寻找假定基因，对其序列比对分析，并进行基因克隆及大肠杆菌异源表达。

（2）通过蛋白纯化，对酶的酶学性质进行研究，确定该酶的催化特性及最适反应条件。

3. 研究的方法与方案

一、实验方案1. pcr扩增akr基因根据akr基因序列设计引物p1，p2，以粘细菌的基因组dna为模板，pcr扩增程序：98 ℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72 ℃10 min。

扩增产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测，回收试剂盒回收后储于-20 ℃。

2.构建表达载体pet29a-akr将回收的akr扩增片段与克隆载体pmd19-t vector连接，转化至 e.coli dh5α，挑取阳性克隆至3 ml 液体 lb，37℃，180 rpm 培养16 h后提质粒电泳，双酶切验证测序。

4. 研究创新点

手型醇为重要的手性中间体，生物催化不对称还原法具有显著的优势。

本课题首次利用基因组挖掘技术，从粘细菌中筛选性能优良的新型醛酮还原酶，丰富了醛酮还原酶的家族成员。

5. 研究计划与进展

2018年3月：akr基因的克隆表达与纯化；2018年4月：AKR的酶学性质及胁迫耐受性测定；2018年5月：总结实验，分析数据，撰写论文。