1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
淀粉分支酶（Strach Branching Enzyme，简称 SBE）是一种重要的淀粉合成和加工用酶，属于糖苷水解酶家族GH13中的一种糖基转移酶，又被成为Q酶，具有双重催化的作用。它一方面可以催化α-1，4-糖苷键的降解，即直链淀粉和支链淀粉的支链区；另一方面可以通过α-1，6-糖苷键将降解的分子片段连接到受体链上，形成更多分支，且非还原端可提供α-1，4-葡萄糖链的进一步延伸，从而改变淀粉的支链架构和支化程度。淀粉中直链与支链的比例、聚合度、重均分子量分布、支链淀粉平均链长和平均分支化度，影响淀粉的物化特性和加工特性。因此淀粉分支酶广泛用于制备高支化淀粉，其产物在食品和医药等行业用途广泛。
淀粉是由葡萄糖单体组成的高聚合物，由直链淀粉和支链淀粉构成，其结构受到多种淀粉合成酶的调控。多数淀粉所含的直链淀粉和支链淀粉的比例为（20%-25%）：（75%-80%），含量较高的支链淀粉和其多变的结构和长度，决定了淀粉颗粒的结构及淀粉本身的特性，进而影响淀粉品质及其应用。在淀粉加工过程中，运用相关淀粉酶对天然淀粉进行重构合成工业需要的淀粉已成为热点研究方向。在淀粉重构过程中，淀粉分支酶是一种重要的工业用酶，通过改变淀粉分支结构进而配合其他类型淀粉酶共同重构淀粉，其应用前景非常广阔，因此新型高效淀粉分支酶资源的筛选与鉴定对于淀粉加工利用至关重要。
目前报道的淀粉分支酶主要来源于植物、动物和微生物，其中植物源的淀粉分支酶的研究多数集中在植物体内淀粉的代谢调控方面。微生物是淀粉分支酶的重要来源，目前具有潜在应用价值的淀粉分支酶多数来源于微生物，由于其无可比拟的优势成为研究的热点。基于目前淀粉分支酶的研究现状，高活性高催化效率的淀粉分支酶的筛选与鉴定对于推动淀粉加工和资源化利用方面具有重要的意义。粘细菌是一类较为特殊的微生物类群，具有特殊的生活发育史，能够产生较为丰富的水解酶类，因此利用生物信息学分析结合分子生物学手段从粘细菌基因组中鉴定高效淀粉分支酶，并利用高效异源表达系统如大肠杆菌进行高效异源表达，研究其酶学特性以及后续应用的潜力，具有较为可行的实施价值。
1.2 研究现状
1.2.1 淀粉分支酶的研究现状
目前国内外对淀粉分支酶相关的研究多集中在植物源的淀粉分支酶在淀粉代谢调控方面的研究以及淀粉分支酶在作物能力代谢以及人源淀粉分支酶在重要疾病预防方面的应用。而淀粉分支酶的工业化应用研究的相对较少。目前报道的具有潜在应用价值的淀粉分支酶多数来源于微生物，且国外在微生物来源的淀粉分支酶的应用及产物性质方面的研究则已经取得了一定的成果（表1）。但是由于其来源不宜获取或者酶异源表达量低或者低催化效率等原因，无法真实实现其应用价值。因此新型高效异源表达量高的淀粉分支酶的研究对于淀粉结构改造和重构方面具有重要的价值。
从表1中可知，不同微生物来源的分支酶在理化特性、底物特异性和反应机制等方面存在显著差异，其特性对于淀粉的改性作用具有重要的影响。因此对不同来源的淀粉分支酶的酶学特性及产物、应用初步探索等研究，对于淀粉重构以及深加工等方向具有重要的价值。
表1 部分已研究的不同微生物来源的分支酶的酶学性质
微生物来源 | 性质 |
Thermus thermophilus | 最适温度为60℃，60℃下半衰期40h，最适pH为6. 5，经纯化后，比活为773. 27U/mg |
Geobacillus thermoglucosidasius | 最适温度为50℃，60℃、70℃下半衰期分别为0. 35h、1. 10h，最适pH为7. 5，pH5. 5-9. 0范围内具有较高的稳定性；Mg2 、Ba2 、K 、Na 在较低浓度下可激活其活力，Ni2 、Co2 有显著抑制作用 |
Rhizomucor miehei | 最适温度25℃，温度稳定性范围在10℃到30℃，底物为直链淀粉 |
Thermomonospora curvata | 最适温度为55℃，最适pH为8. 5，底物为直链淀粉；聚合度DP＜13的支链淀粉短链的数量从20. 19%加到32. 59％，DP＞25从25. 58%减至10. 03％，13 从54. 23％增加至58. 38％ |
Streptococcus mutans | 最适温度40℃，活性在pH5. 0为最佳，主要作用于短麦芽寡糖基链，聚合度DP为6和7 |
Anaerobranca gottschalkii | 酶蛋白72kDa，在50℃、pH7.0显示最大活性，以直链淀粉为底物时显示较强的转糖基作用和极低的水解活性 |
Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum LY34 | 酶分子量约为84kDa，在pH 7.0和40℃时具有最佳的活性。与大肠杆菌的分支酶最相似并含有α-淀粉酶家族中的保守四区域。 |
G.Thermoglucosidans STB02 | 最适温度50℃，最适pH7.5；对玉米淀粉作用10h，支链平均链长减小11.8%，外链长度减小21.3%，内链长度增大17.5% |
Rhodothermus obamensis | 最适温度30℃，最适pH为7.0，主要产生聚合度3-8的分支，较优底物为支链葡聚糖，会形成直径为30-70nm的超分支颗粒（糊精） |
1.2.2 粘细菌产生丰富水解酶类
粘细菌是一种革兰氏阴性菌，单细胞呈现杆状，其显著特点是可以形成子实体结构。因为其具有可滑行的特征，菌落在化合物表面呈现扩散状。粘细菌子实体在19世纪初才首次被发现，但将该菌从真菌类别划分为粘细菌并详细阐述其生活史的工作，则几乎到20世纪才完成并被认同。近些年来关于粘细菌的研究成果和报道越来越多，其生长过程中特有的社会性行为和独特的发育过程逐渐被人们所关注，现已作为一种模式生物来研究多细胞结构的形成机制。由于粘细菌独特的社会地位和细胞行为方式以及其生活过程中分泌的丰富的次级代谢产物，决定着粘细菌现已成为一类重要的资源库。前期研究发现，粘细菌会利用大分子物质如蛋白类和糖类来满足自身生长的营养需求，而在水解该类有机物过程中需要大量的水解酶类，包括蛋白酶，糖苷水解酶以及肽酶等，其中已有学者在1992年报道了来源于Myxococcus coralloides D的α-淀粉酶，并对其酶学性质进行了初步探究，由此发现珊瑚球菌属菌株能够很好地利用淀粉。目前粘细菌来源的水解酶类包括淀粉水解酶，木聚糖水解酶，纤维素水解酶，琼脂糖水解酶以及金属肽酶等，基于现状以粘细菌为菌种资源，开发具有潜在价值的水解酶类已成为研究的热点。
1.3 应用前景
淀粉是自然界中含量最为丰富的糖水化合物之一，利用天然淀粉进行后续加工处理进程淀粉产物的深加工处理已成为重要的研究方向。淀粉分支酶是一类重要的淀粉重构用酶，在淀粉分支处理方面具有重要的应用价值，其可来源于植物、动物和微生物，但目前国内所发现的淀粉分支酶主要来源于植物，控制淀粉分支酶在植物中基因的表达，可控制植物产生的直链淀粉和支链淀粉的含量及比例。比如，支链淀粉就是稻米淀粉的主要贮藏形式，稻米中大约70%以上的淀粉是支链淀粉，其含量与稻米的产量和品质都密切相关；同时有研究发现，支链淀粉积累速率与淀粉分支酶活性相关显著。因此对淀粉分支酶进行调控，可以改变支链淀粉的含量，从而改变植物口感、品质和产量等。
但这些研究主要集中在淀粉代谢方面的研究，对于新型高效淀粉分支酶的应用性探索研究相对较少，其中微生物是淀粉分支酶的重要来源。粘细菌是一类特殊的微生物类群，具有真菌的发育特征，细菌基因组较大，在生命活动过程中能够产生丰富的次级代谢产物和水解酶类。本研究拟以粘细菌作为研究对象，从粘细菌基因组中开发新型高效具有潜在应用价值的淀粉分支酶类，并对分支酶的糖链转移长度及效率进行详细研究，后期将重构淀粉在食品行业中应用进行初步的探索，包括面包抗老化，可降解性淀粉保鲜膜以及低聚糖的制备等方面的应用潜力。
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2. 研究的基本内容和问题
2.1 课题研究目标
本课题以菌株corallococcussp. egb为材料，克隆获得新型淀粉分支酶编码基因，并将获得的功能基因在大肠杆菌中进行异源表达，并进行酶学特性的相关研究，同时对该分支酶在淀粉加工方面的应用潜力进行初步的评估。
2.2 研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1拟采取的研究方法、技术路线
胞内表达载体构建→原核表达（大肠杆菌为宿主）→蛋白纯化→测酶体系建立→酶学特性研究→应用性初步评估
3.2 可行性分析
4. 研究创新点
克隆获得的淀粉分支酶氨基酸序列新颖性高，与已报道的相关蛋白同源性较低，同时该酶活性较高，具有潜在的应用价值。
5. 研究计划与进展
2018.3 胞内表达载体构建并成功表达
2018.4-5 提取淀粉分支酶并进行酶学性质测定和研究
