菌株Pigmentiphaga sp. H8对3，5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解研究开题报告

1 本课题研究意义

1．1 研究背景及意义

卤代芳烃类化合物具有稳定性好、耐疲劳、阻燃、耐热等特性，广泛用于工农业生产，如农药、染料、医药、化学中间体、助溶剂、合成材料等^{[3, 19]}。这些卤代化合物通过各种途径进入水体、大气和土壤环境，造成全球性的环境污染^[23]。由于卤素的电负性强，其与碳原子形成很强的共价键，增加在环境中的持久性，这也是大多数卤代化合物被列为持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants, POPs）和优先控制污染物（Priority pollutants）的原因^{[1, 2]}。由于卤素原子有强烈的吸电子效应，从而使得分子极性增加，更易与酶系统结合，卤素的取代会导致化合物毒性的增强。所以，很多卤代化合物具有难降解性、高毒性、致畸致癌和生物富集等特点，对环境和生态系统造成严重的影响^{[8, 25]}。因此，脱卤是卤代化合物去毒化和降解的关键，卤素原子的去除不仅可以增加化合物的可降解性，而且可以降低化合物形成毒性产物的风险^{[22, 23]}。卤代化合物的脱卤研究是当前研究的热点^[15]。

卤代苯甲酸是微生物脱卤研究的模式化合物。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（3,5-dibromo-4-hydroxybenzoate, DBHB）是除草剂溴苯腈主要的中间代谢产物^{[6, 20]}。由于溴苯腈的广泛使用，环境中检测到其代谢产物DBHB有很多报道 ^{[10, 12, 17]}。溴苯腈去除草活性和抗溴苯腈除草剂转基因作物的培育已有相关研究^{[16, 18]}，比如从菌株Klebsiella pneumoniae subsp. Ozaenae中克隆出的溴苯腈腈水解酶基因bxn成功转入到双子叶植物如烟草、西红柿、棉花中，培育出抗溴苯腈的转基因作物并实现产业化种植^{[11, 24]}。但是，Bxn作用于溴苯腈的水解产物正是DBHB。由于卤素的存在，DBHB在环境中具有一定的污染风险。而关于DBHB的降解研究严重滞后，2013年Chen等首次从溴苯腈矿化菌株Comamonas sp. 7D-2中发现了DBHB的还原脱溴酶BhbA，它能对DBHB进行两步还原脱溴，分别生成3-溴-4-羟基苯甲酸（3-bromo-4-hydroxybenzoate,BHB）和4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate, HB），并从酶学水平阐述了BhbA的还原脱溴机制^[5]。

有趣的是DBHB也是一种可以在海洋生态系统中自发生成的物质，如绿藻类生物石莼可以自发产生DBHB^{[9, 13]}。因此，研究DBHB的微生物脱卤，对于研究海洋环境中的卤素循环也有一定的意义。

申请者所在实验室已分离筛选到一株能完全降解DBHB的好氧菌株Pigmentiphaga sp. H8，该菌株能在48 h内将0.2 mM的DBHB和BHB完全降解，并且释放出溴离子。通过HPLC检测，确定菌株H8降解DBHB的产物不同于以往文章中报道的还原脱溴产物3-溴-4-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸，显示DBHB不是通过还原脱溴方式脱卤，强烈暗示有新的脱溴途径和脱溴机制存在。

因此，本项目拟以3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（DBHB）为目标化合物，研究好氧菌株Pigmentiphaga sp. H8降解DBHB新的代谢途径，克隆降解关键酶基因，丰富溴代芳烃类化合物的微生物降解机制研究，为溴代芳烃类化合物的生物降解和污染修复提供技术支持，也可为研究海洋环境中溴代芳烃的卤素循环提供基础。

1．2国内外研究现状及发展动态分析

卤代芳烃类化合物（Halogenated aromatic compounds, HACs）的微生物脱卤研究一直是学术界密切关注的课题。氯代苯甲酸（2-/3-/4-氯苯甲酸）是微生物脱氯研究的模式化合物^{[14, 21]}。本项目以结构稍复杂的二溴代羟基苯甲酸（3,5-二溴-4-羟基苯甲酸，

DBHB）作为研究对象，分离好氧微生物脱溴菌株，以期丰富微生物的脱溴机制。目前关于DBHB降解的研究报道很少。严格厌氧菌Desulfitobacterium chlororespirans以3,5-二溴-4-羟基苯甲酸为电子受体进行呼吸型还原脱卤并产生终产物4-羟基苯甲酸^[7]，该过程可产生能量并用于菌株自身的生命活动。关于DBHB的好氧微生物降解也有报道。Cai等人通过MS/MS鉴定代谢产物，发现Acinetobacter sp. XB2能将溴苯腈水解为DBHB，随后DBHB还原脱去一份溴离子，生成3-溴-4-羟基苯甲酸（BHB）^[4]。但是，该代谢途径完全是基于MS/MS鉴定产物的推测，脱卤机制没有基因和酶学等分子水平的阐明。2013年，Chen等从溴苯腈矿化菌株Comamonas sp. 7D-2中发现一个新的还原脱卤酶BhbA，该酶由N端的厌氧微生物呼吸型还原脱卤酶RdhA（respiration-linkedreductive dehalogenase）和C端的NAD(P)H依赖型的氧化还原酶（NAD(P)H-dependent oxidoreductase domain）组成，并从分子水平阐述了BhbA将DBHB还原脱溴生成BHB和4-羟基苯甲酸的催化机制^[5]。

由于DBHB降解机制研究还不够深入，而且DBHB好氧微生物的降解机制还存在多样性，选择DBHB为靶标化合物，研究DBHB在好氧微生物中新的降解机制具有重要的科学意义。

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3 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

3．1 研究方法及实验方案

3．1．1 3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（DBHB）及其代谢产物的测定

HPLC检测：样品经过冷冻干燥后加入适量甲醇溶解，用0.22 μm的有机相滤膜过滤，然后HPLC检测。HPLC检测条件：流速0.8 mLmin^-1；检测器波长221 nm和250 nm；流动相，乙腈：水：乙酸 = 50：50：0.5 (V/V/V)； C₁₈反相色谱柱，250 mm 4.6 mm，柱温40 C。

LC-MS检测：样品经过冷冻干燥后加入适量甲醇溶解，用0.22 μm的有机相滤膜过滤后上机检测。仪器，LC-MSD-Trap-SL（USA）；离子源，electrospray，阴离子模式；LC-MS紫外检测波长250nm；质量扫描范围50到400 m/z。

3．1．2 菌株H8降解DBHB的代谢途径分析

静息细胞法：将菌株H8接种于以DBHB为唯一碳源的1L无机盐培养基中大量培养(为了获得大量的菌体，可以加入终浓度为0.2%的酵母膏)。收集菌体，用无菌水洗涤菌体三次，然后加入10 mL 无菌水重悬菌体。将菌悬液加至含有0.2 mM DBHB的100 mL 无机盐培养基中，调节菌体浓度OD₆₀₀至0.8。每隔4 h取样5mL，离心后取上清液冷冻干燥。使用0.5 mL甲醇溶解冻干产物，用于HPLC和LC-MS等测定代谢产物。最后根据代谢产物，推测菌株H8降解DBHB的代谢途径。

3．1．3 DBHB降解关键酶基因的克隆

异源表达：将预测的基因借助合适的载体（比如pUC18，pBBR1MCS系列载体等），分别转至无降解功能的宿主（如E.coli DH5α, Pseudomonas putida KT2440等）中表达，并且作用于DBHB，验证其有无降解功能。

基因敲除和基因互补：分别将预测的基因在原始菌株H8中敲除（利用阴性菌接合转移型质粒和sacB反向筛选标记进行基因插入失活或删除），然后将突变株作用于对应的底物，验证相应的降解功能是否丧失。若降解功能丧失，则可通过阴性菌的广宿主质粒(如pBBR1MCS系列载体)将该基因互补至突变株中，验证降解功能是否恢复，从而进一步确定该基因的功能。

3．1．4 降解关键酶的酶活测定

酶促反应标准体系：3 mL PBS缓冲液 (含0.1 mM DBHB，适量的酶，按需添加适量的辅因子，pH 7.4)，30℃条件下，反应时间根据不同的底物控制反应时间，保证已经反应的底物浓度不超过底物初始浓度的30%。

降解关键酶的酶活测定：在标准酶促反应体系中，以加入酶开始计时，最后用100 μL 5M HCl终止反应，液相色谱或者气相色谱检测底物和生成产物的量。一个酶活力单位(U)定义为：在pH 7.4，温度30℃条件下，每分钟从转化1 μmol DBHB生成产物所需要的酶量。

3．2 可行性分析

本项目从实验条件角度可行。所在实验室为农业部农业环境微生物重点实验室，从事该研究多年，拥有开展微生物学、分子生物学等研究所必须的大量仪器和设备。

本项目从技术角度来看是可行的。首先，借助三代测序技术获得的基因组数据完整可靠，结合分析比对，可预测寻找BHB的降解基因；其次，蛋白质分级纯化法属于成熟的经典方法。此外，本项目使用的分子生物学方法如基因敲除和互补，基因表达和酶的纯化，酶学研究等都属于经典成熟的传统方法，不存在任何技术难度。