1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
细胞自噬（autophagy）是发生在所有真核细胞中的一个主要降解途径，它是用于回收细胞质在压力条件下产生的大分子物质和能量，以除去多余和受损的细胞器以适应不断变化的营养条件，并维持细胞稳态(suzuki and ohsumi 2007)。此外，自噬在细胞保护中发挥重要作用，它能阻止有毒物质的积累，在免疫的许多方面都发挥作用，包括消除入侵的微生物和参与抗原递呈(seay et al. 2006; hayward et al. 2009; lenz et al. 2011; liu and bassham 2012)。二十世纪九十年代初, 以daniel j.klionsky、yoshinori ohsumi为代表的一批细胞生物学家以酿酒酵母(sa ccharomyces cerevisiae)为模式生物展开了相关基因的筛选和细胞生物学的研究。经过二十多年的积累, 酵母己成为细胞自噬分子机制研究最为充分的模式生物。
酿酒酵母囊泡运输途径中存在着七种大分子多亚基复合体，它们均作为拴系因子调控不同细胞器间的囊泡与区系的拴系过程(cai et al. 2007; schmitt 2010)。随着研究的进展，一系列证据表明，其中一些大分子复合体不仅参与囊泡运输过程，同时也影响了细胞自噬过程。如在酿酒酵母中，调控高尔基体内部物质运输的大分子复合体cog，同时也调控细胞自噬过程中自噬体的形成(yen et al. 2010)。调控反面高尔基与质膜之间囊泡运输的excoyst复合体突变均显著影响细胞自噬(geng et al. 2010, bodemann et al. 2011)。调控内吞运输途径的hops复合体和corvet复合体，分别调控着细胞自噬过程中自噬体与液泡的融合和自噬体的成熟过程(chen et al. 2014)。我欲开展科研训练所在的实验室也有文章表明调控物质进出高尔基体的trappi和trappii复合体，也同样参与细胞自噬过程(zou et al. 2013; zou et al. 2015)。因此，多数参与囊泡运输的大分子复合体均参与调控细胞自噬。深入探讨这些大分子复合体参与细胞自噬分子机制，对解析细胞自噬的调控机制及应用具有非常重要的意义。
dsl1复合体调控着高尔基体到内质网物质运输中，copi囊泡与内质网的拴系过程。在这一过程中，dsl1复合体定位于内质网上(schmitt 2010; spang 2012)。最新的研究发现，内质网是自噬体形成过程中，自噬体膜的重要来源(ge et al. 2013; graef et al. 2013)，但定位于内质网的dsl1复合体是否参与细胞自噬过程并不清晰。因此，本课题以dsl1复合体亚基tip20为研究对象，探讨dsl1复合体是否影响细胞自噬以及tip20亚基在细胞自噬中可能存在的功能。
2. 研究的基本内容和问题
1、课题研究目标
通过对tip20亚基的研究，初步阐明dsl1复合体是否影响细胞自噬及相应的调控机制。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
1.1克隆目的基因片段
利用已知的目的基因两端的序列设计引物，从野生型酵母菌的基因组DNA中，通过PCR技术扩增目的基因。
1.2 酵母菌中的质粒整合和转化
利用单交换将带有GFP-Atg8的质粒整合到酵母菌基因组中，采用选择培养基筛选出含有GFP-Atg8的酵母菌。
1.3细胞培养及荧光显微镜观察
将标记有GFP-Atg8的菌株在营养丰富的液体培养基中进行培养至对数期后，换
缺少氮源的培养基诱导细胞自噬发生，通过荧光显微镜观察GFP-A tg8在野生型和突变体中的定位。
1.4 Western blot检测细胞自噬水平
Western blot 检测限制性温度处理时GFP-Atg8在野生型及tip20ts菌株中蛋白变化情况。
2、技术路线
若突变对细胞自噬有影响，克隆TIP20回补到突变株中并用荧光显微技术观察Atg8的定位 |
Western blot检测在野生型、atg1及tip20ts中GFP-Atg8的降解水平 |
Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）菌株 WT、tip20ts |
预实验检测TIP20突变对细胞自噬的影响 |
26C下培养6h |
37C下培养30min |
营养丰富处理（选择性自噬） |
饥饿处理（非选择性自噬） |
荧光显微技术分别观察Atg8在活体酵母WT和tip20ts突变株中的定位 |
分析实验结果，初步判断TIP20对细胞自噬的影响 |
3、实验方案
3.1探究TIP20突变是否影响细胞自噬
通过分别控制不同的营养条件，比较野生型与tip20ts中GFP-Atg8蛋白在细胞中的定位，初步确定Tip20是否会影响自噬。
3.2 Western blot检测细胞自噬的发生水平
为了进一步确认tip20ts对自噬的影响，通过Western blot检测GFP-Atg8降解的量来反应细胞自噬的发生水平。
3.3 明确TIP20突变对细胞自噬的影响
在初步确认Tip20对细胞自噬有影响之后，克隆目的基因TIP20回补至突变株中，观察回补本身基因后的突变体中GFP-Atg8的定位。
4、可行性分析
本项目立项依据充分，实验室已经获得TIP20点突变体菌株，为实验的顺利进行奠定基础。本人所在实验室熟练掌握基因克隆、荧光蛋白标记、不同遗传背景菌株的制备、等关键技术，且本人所在课题组已使用相关技术和方法在主流杂志上发表多篇论文。因此，本项目所采用的关键技术和研究方法是有保障的。
4. 研究创新点
首次探讨Dsl1复合体亚基Tip20在细胞自噬中的功能，这对完善细胞Dsl1复合体在细胞自噬中的调控机制具有重要的意义。
5. 研究计划与进展
9.2010.10整合gfp-atg8至酵母菌，比较野生株与突变株荧光蛋白分布的区别
10.1011.20克隆出tip20，并转化到相应突变体中；敲除atg1
11.2012.30比较回补后的菌株与野生型荧光蛋白分布
