1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
细胞自噬是依赖于细胞内溶酶体（酵母中为液泡）介导的一种细胞内物质降解途径，它在真核生物体中普遍存在且高度保守。它通过形成一种叫做自噬小体的双层膜结构来包裹细胞质物质和一些受损的细胞器，并最终与溶酶体（酵母中为液泡）发生融合，以完成对所包裹物质的降解(zhang et al. 2009; yang and klionsky 2010)。根据包裹物质及运送方式的不同，细胞自噬可以分为宏自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬（王海燕等.2009）。通过细胞自噬途径细胞内非正常折叠的蛋白质及受损的细胞器被降解用于新物质的合成，形成保持细胞正常运转的动态平衡，进而影响生物体的生理及病理过程(suzuki andohsumi 2007)。
细胞自噬现象在真核生物中广泛存在，但酿酒酵母仍是研究细胞自噬分子机制最为充分的模式生物。迄今酵母菌中已发现34个基因直接参与细胞自噬过程，并被命名为细胞自噬相关基因（autophagy-related genes，atg）(klionsky et al. 2003)。然而，除上述自噬基因所编码的自噬蛋白会影响细胞自噬过程外，细胞内一些参与其它生理过程的蛋白在细胞自噬过程中的作用也不断有报道(ohashi andmunro 2010; van der vaart et al.2010; yi et al. 2012; chen et al. 2014; tanaka et al. 2014) ，但对具体调控机制的了解仍十分有限。
snare（可溶性n-乙基-马来酰胺敏感因子结合蛋白受体）蛋白是介导囊泡与细胞膜或其他细胞膜融合的主要蛋白分子(sollner etal. 1993; chen and scheller 2001)，担负着囊泡运输中囊泡与区系的融合过程(左明雪 2012)。近年来研究表明snare蛋白同时参与细胞自噬过程，但不同的snare蛋白调控细胞自噬的分子机制也不尽相同。如参与酿酒酵母中胞吞运输的snare蛋白sso1/2和sec9调控细胞自噬过程中atg9小泡的运输，从而影响自噬体双层膜的扩张(nair etal. 2011)。参与囊泡与液泡融合的snare蛋白vam3同样也参与细胞自噬过程，它调控着自噬体外膜与液泡膜的融合(darsow et al. 1997)。sec20是定位于内质网上的snare蛋白,它与定位于内质网上大分子复合体dsl1及另外两个snare蛋白ufe1和use1,形成一个稳定的复合物(spang 2012)，调控copi囊泡与内质网的融合(diefenbacher et al. 2011; rogers et al.2014)。本实验室前期研究工作发现，dsl1复合体影响细胞自噬的正常运输过程，而与dsl1复合体存在联系的snare蛋白是否同样也参与细胞自噬过程？因此本研究以snare蛋白sec20为研究对象，探讨其在细胞自噬中可能存在的功能。
2. 研究的基本内容和问题
1、课题研究目标
检测酿酒酵母中snares蛋白sec20缺失是否会引起细胞自噬缺陷，并且初步探讨其影响细胞自噬的调控机制。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
1.1克隆目标基因片段并构建到高拷贝载体中
利用已知的目的基因SEC20两端的序列设计引物，从野生型酵母菌的基因组DNA中，通过PCR扩增技术，获得目的基因，并将其克隆重组至pRS423载体中。
1.2通过质粒载体将 GFP-Atg8整合到酵母基因组上
通过酶切的方法将带有GFP-Atg8的质粒整合到酿酒酵母野生型和sec20ts的基因组上。
1.3细胞培养及荧光显微镜观察
野生型和突变体菌株（sec20ts）用GFP标记Atg8，从而可以用荧光显微镜观察这个关键的细胞自噬蛋白在细胞内的定位，通过比较野生型和突变体中这些荧光蛋白的变化情况来判断Sec20突变对细胞自噬的影响情况。
1.4 Western-Blot测定细胞自噬发生水平
通过Western-Blot（蛋白质印迹法）比较野生型与sec20ts中GFP-Atg8的降解水平，从而定性确定Sec20对细胞自噬的影响程度。
2. 技术路线
详见附件
3. 实验方案
3.1实验检测SEC20突变是否影响细胞自噬
通过比较野生型与Sec20缺陷的突变型酵母中GFP-Atg8蛋白在细胞中的分布情况，初步确定Sec20是否会影响自噬。
3.2定量检测Sec20影响细胞自噬发生水平
为了进一步确认sec20ts对自噬的影响，通过Western blot检测比较野生型与突变体中GFP-Atg8降解的量来反应细胞自噬的发生水平。
3.3 确定SEC20影响细胞自噬
为了进一步确认Sec20对细胞自噬产生了影响，在sec20ts突变体中转化重组有SEC20基因的质粒，观察回补后的突变体菌株细胞自噬现象是否恢复正常，从而确定SEC20基因与自噬过程有关联。
4.可行性分析
本项目立项依据充分，并且已经获得实验所需突变体材料。本人熟练掌握基因克隆、荧光蛋白标记、不同遗传背景菌株的制备、等实验所需的关键技术。另外，本实验室所具备的仪器设备及依托单位南京农业大学生命科学实验中心和农业部农业环境微生物重点开放实验室所提供的平台也将为实验的顺利开展提供充分的保证。将确保本项目在经费预算范围内和研究计划时间内顺利完成。
4. 研究创新点
本实验首次探讨调控高尔基到内质网之间囊泡运输的转运、融合的SNARE蛋白Sec20参与细胞自噬过程，这对进一步阐明细胞自噬发生的分子机制具有重要的意义。
5. 研究计划与进展
9.109.15阅读相关文献、撰写开题报告
9.2010.15将gfp-atg8整合到酵母菌sec20ts和野生型菌株中
10.1510.30观察生长表型及荧光
