酿酒酵母中Sec14影响细胞自噬的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

细胞自噬（autophagy）是真核细胞中特有的一种机制，是细胞清除过多的或损坏了的蛋白质和细胞器的途径(yang and klionsky 2010)。

这一现象最早是由ashford和porter用电子显微镜在人的肝细胞中观察到(ashford and porter 1962) 。

近10年来，人们对细胞自噬有了更深的了解。

2. 研究的基本内容和问题

1、课题研究目标确认sec14缺失突变体中所出现的自噬缺陷确实由相应的基因突变所引起。

　　　2、研究内容　　　1）克隆目标基因sec14，构建回补质粒。

　　　2）将上述质粒整合到相应突变体中，通过荧光显微镜观察来确认酵母内的细胞自噬情况。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法　　　1.1克隆目标基因片段并构建到高拷贝载体中　　　利用已知的目标基因两端的序列设计引物，从野生型酵母菌的基因组dna中，通过pcr技术可以获得目的基因，并将其克隆到prs423载体中。

　　　1.2 酵母菌中的质粒转化　　　通过电转化方法将质粒转化到大肠杆菌中，用小抽离质粒法纯化质粒，再通过醋酸锂法将质粒转化到酵母sec14突变体中。

　　　1.3细胞培养及荧光显微镜观察　　　对野生型和突变体菌株（sec14ts）用gfp标记atg9-3xgfp，从而可以用荧光显微镜对这个关键的细胞自噬蛋白在细胞内的分布进行定位，通过比较野生型和突变体中这些荧光蛋白的变化情况来判断sec14突变对细胞自噬的影响情况。

4. 研究创新点

关于酿酒酵母中调控囊泡运输的Sec14对细胞自噬的影响，这一研究内容至今未见报道。

5. 研究计划与进展

2.203.20整合Atg9-3XGFP至酵母菌，敲除Atg13.204.15克隆出sec14、pRS423，并转化到相应突变体中4.154.30观察生长表型及荧光5.15.20写毕业论文