探究E3泛素连接酶CHIP对C型凝集素受体CLEC-2的调控开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1 本课题的意义、研究概况及应用前景

c型凝集素样受体-2(clec-2)是一个非经典型的c型凝集素受体，主要表达在血小板、中性粒细胞等细胞表面。clec-2的转录体在外周血细胞、髓性细胞(单核细胞、树突状细胞和粒细胞)、自然杀伤细胞和肝有分布,但是目前流式细胞实验只检测到clec-2在血小板和巨核细胞表面表达。很多研究显示：clec-2在血小板活化聚集、肿瘤转移、血栓形成以及hiv在体内扩散中起着重要的作用。因此，clec-2可作为治疗相关疾病的靶蛋白，特异性的下调clec-2或者其下游信号，抑制血小板的活化，阻止肿瘤细胞逃逸。但还未有相关报道阐明这种特异性的靶点。

chip，即hsc70 c末端结合蛋白 (carboxy terminus of hsc70 interacting protein)是一个物种间氨基酸序列高度保守的胞浆蛋白，是一种e3泛素连接酶。该蛋白n端存在3个tpr(tetratricopepdide repeat)结构域，c端有1个u-box结构结构域，以及一个连接区域。chip通过它的tpr结构域与分子伴侣hsc70-hsp70 和hsp90结合，而u-box域含有e3泛素连接酶活性。chip在蛋白酶体和分子间起连接的功能，其与分子伴侣结合可导致相应靶蛋白的泛素化，从而促进多种蛋白底物被泛素-蛋白酶体系统降解和清除，参与细胞内蛋白质的质量控制，调节细胞的生理或病理过程，在心肌细胞损伤、细胞凋亡、肿瘤等方面有重要作用。chip能降解带有疾病信号的蛋白，比如乳腺癌和卵巢癌中的erbb2可能起干预治疗的作用。所以，chip有可能作为一种药物，指向性的使与之结合的蛋白降解，从而阻断该蛋白的下游信号通路，阻止其相应功能的发挥。

2. 研究的基本内容和问题

2.1 研究目标

1）研究chip是否下调clec-2含量。

2）研究chip与clec-2是否存在相互作用。

3. 研究的方法与方案

3.1研究方法

1）分子克隆构建表达CHIP-Flag质粒。

2）在293T细胞中共同转染CLEC2-myc和不同浓度的CHIP，通过免疫印迹western blot检测CLEC2-myc的表达。

3）通过免疫共沉淀实验、激光共聚焦实验确定CHIP与CLEC-2存在相互作用。

3.2技术路线

构建质粒以及培养293t细胞→转染293t细胞（CHIP、CLEC-2）→①

提取蛋白，通过western blot检测蛋白表达；②提取蛋白，通过免疫共沉淀 CHIP与CLEC-2是否存在相互作用；③通过激光共聚焦实验进一步确定CHIP和CLEC-2存在相互作用

3.3实验方案

3.3.1分子克隆

1)PCR反应获得CHIP的基因序列。

2）限制性内切酶酶切反应。

3）用胶回收试剂盒回收DNA片段。

4）将片段和载体用DNA连接酶在4℃连接过夜，约16h。

5）制备大肠杆菌E.coli感受态细胞。

6）转化E.coli感受态细胞（CaCl₂ 方法）

7）挑取4个生长在含有Amp的LB固体培养板上的单克隆菌落，接种于3ml含Amp的LB培养基中，37℃恒温，振荡培养过夜，用碱裂解法少量制备细菌质粒DNA。酶切鉴定含有阳性片段的质粒DNA，将相应的E.coli细胞保种，保存于－20℃。

8）用质粒抽提试剂盒制备用于转染的质粒DNA。

3.3.2浓度梯度转染试验

1）细胞培养：所用细胞293t为实验室冻存的细胞系，经过复苏、培养、传代。

2）转染：传代后，待细胞长到对数期，约70-80%，CHIP-Flag与CLEC2-myc质粒以合适比例共同转染293t细胞，26h给细胞加入DMSO或MG132，继续培养4h后收集细胞。

3）提蛋白：收集细胞离心后去上清，酌量加入裂解液，在冰上裂解30分钟后加5xloading buffer，沸水煮10分钟。

4）western blot检测蛋白表达。

3.3.3免疫共沉淀试验（IP）

1）将CHIP与CLEC-2质粒转染入293t中，转染后26h给细胞加入DMSO或MG132，继续培养4h，收细胞，用1xIP裂解液裂解细胞，在4℃冰箱中轮转2h。

2）用预冷的PBS洗珠子，将珠子在4℃冰箱中轮转10分钟，重复三次

3）将裂解的细胞离心后去上清，一部分直接加入loading buffer沸水煮10min后保存。

4）将剩余上清加入抗体在冰箱4℃轮转孵育1h，然后加入洗好的珠子结合，再用预冷的PBS洗三次，加入loading buffer沸水煮10分钟。

5）通过western blot检测蛋白表达及相互作用。

3.3.4荧光共聚焦显微镜观察（confocal）

1）培养细胞：将Hela细胞传代培养至细胞对数生长期，消化细胞。

2）制片：将细胞接种到放置有处理过的盖玻片的培养皿中，孵育。

4) 转染：CHIP-Flag与CLEC2-myc质粒以1:1比例共同转染细胞。

5) 培养28小时后，固定、透化细胞，分别用Flag和myc的一抗及荧光抗体孵育。

6） 封片，并使用带有荧光素滤光片的共聚焦显微镜观察细胞。

3.4可行性分析

本人所在实验室为卫生部糖复合物重点实验室，实验室多年来从事糖复合物结构与功能研究，实验室的前期研究中已经探究了RACK1等分子对CLEC-2的调控作用。这些研究结果不仅为本项目的研究背景奠定了重要基础，同时为今后进一步探究CLEC-2降解机制，进而揭示肿瘤逃逸的分子机制积累了资料，具有十分重要理论意义。

另外本实验室条件充裕，在细胞培养、转染，DNA、RNA提取等方面都技术成熟，具备此次实验所需的各种器材、试剂。本研究所涉及的背景知识我已经熟悉，对本研究所需的实验设备，我已经掌握了操作技术。

4. 研究创新点

CLEC-2作为一种新发现的C型凝集素受体在血小板聚集、肿瘤转移等生理过程中有着重要作用，是研究血小板相关疾病的要分子，目前已有RACK1等分子对CLEC-2的作用研究，但泛素连接酶CHIP与CLEC-2相互作用的机制与功能鲜有报道。本实验通过研究泛素连接酶CHIP调节C型凝集素受体CLEC-2信号的机制和功能以期对癌症治疗中抑制肿瘤转移有借鉴作用。

5. 研究计划与进展

2014年2月到3月 查阅文献，了解熟悉试验流程，掌握试验重要环节和关键步骤并进行预实验

2014年3月到5月 撰写开题报告，完成全部实验，记录与处理实验结果与数据

2014年5月到6月 撰写毕业论文并准备答辩