1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
螺原体(spiroplasma)是一类基本形态为螺旋形原核微生物，无细胞壁，但在系统发育分析上属革兰氏阳性菌，具有滤过性，能独立生活和自我复制，属于细菌域(bacteria)，厚壁菌门(firmicutes)，柔膜菌纲(mollicutes)，虫原体目(entomoplasmatale)，螺原体科(spiroplasmataceae)，螺原体属(spiroplasma)。目前发现的螺原体有34个血清组，其中血清组Ⅰ有9个亚组，血清组Ⅷ和ⅩⅥ各有3个亚组，但仅38个种给与拉丁文双名并被详细描述。螺原体主要存在于昆虫体内、植物体内和植物花表面,它和宿主的关系可分为互惠共生(mutualism)、寄生(parasitism）和共栖(commensalism)三种，其中大多数为共栖关系(clarketal.,1987;hackettandclark,1989)。1976年，在美国maryland州首次发现由s.melliferum引起的一种蜜蜂病害螺原体死亡病(spiroplasmosis)；在国内，陈永萱等于1988年首次从患爬蜂病的蜜蜂体内分离到螺原体菌株ch-1，并对其基本生物学特性作了详细的研究(陈永萱,1988)。迄今为止，致病螺原体已报到过多种，其基本生物学特性也有详细研究，但致病机制方面的研究仍然很少。蜜蜂螺原体病在我国养蜂地区普遍发生，严重制约着我国养蜂业的发展。通过测定引起我国蜜蜂爬蜂病的主要病原s.melliferumch-1基因组草图，与非致病螺原体比较，可以探索ch-1中可能存在的几种致病因子，例如几丁质脱乙酰基酶基因在s.melliferum中属于特有基因，已测序并报道的其他螺原体基因组中并未发现与这个酶有关的基因(lowen-suietal.,2013)。
大多数几丁质脱乙酰基酶生产菌对真菌具有拮抗作用，且多数几丁质脱乙酰基酶在离体情况下也能抑制真菌的生长，这些发现使得人们开始着手研究几丁质脱乙酰基酶的生物防治。dixit等研究几丁质脱乙酰基酶的作用时发现，它参与改变蓓带夜蛾(mamestraconfigurata)围食膜中几丁质的物理和化学性质，而这一生化过程不仅改变几丁质的纤维结构，而且对围食膜蛋白的结合程度、围食膜的完整性和孔隙率产生影响(dixitetal.,2008)。据此研究人员推测几丁质酶和几丁质脱乙酰基酶在蜜蜂螺原体侵入蜜蜂肠道过程中起到了关键作用(alexeevetal.,2011)。
蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰基酶的理化性质、空间结构以及功能域较其他细菌有何不同，其在螺原体致病过程中发挥的作用等都有待深入研究。本次对几丁质脱乙酰基酶进行诱导、纯化、最适温度、最适ph等的研究，有利于我们进一步了解几丁质脱乙酰基酶在螺原体致病过程中的作用，并通过控制几丁质脱乙酰基酶的方法来生物防治蜜蜂的螺原体死亡病。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
几丁质脱乙酰基酶可能是螺原体s.melliferum的致病相关因子，参与螺原体对宿主昆虫的吸附和入侵。本研究首先克隆螺原体中编码几丁质脱乙酰基酶的基因cda，然后，构建载体在大肠杆菌中外源表达该基因，进一步纯化几丁质脱乙酰基酶，测定几丁质脱乙酰基酶的各项理化性质。研究结果可以为深入了解几丁质脱乙酰基酶在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1、螺原体ch-1基因组中几丁质脱乙酰基酶相关基因的克隆表达
（1）用ctab/nacl法提取螺原体ch-1的基因组，根据基因序列，用primer5设计带有酶切位点和保护碱基的引物，overlapextensionpcr(oe-pcr)扩增cda基因。
4. 研究创新点
本次的研究主要是集中在对几丁质脱乙酰基酶的活力测定，对酶最适反应pH及pH稳定性、酶的最适反应温度和热稳定性测试中，我们用3组重复取其平均值作为最后的结果，降低在实验的误差。我们在用新的酶液时，同时还会再次用上次用过的酶液进行再一次的验证，确保每次的实验误差是最小的。
我们这个实验对酶液消耗量相当大，差不多是每做完一次实验后，就要进行下一次的酶液培养。这样可以确保我们的酶液中酶的活力是好的，确保酶的最好活力。
5. 研究计划与进展
本次研究在一开始是就是在前人的基础上开展的。所以，我们进行iptg诱导表达重组蛋白，然后进行几丁质脱乙酰基酶进行nta-ni柱纯化。最后就是测得几丁质脱乙酰基酶的基本酶学性质，完成几丁质脱乙酰基酶活力测定。
2014年3月查阅国内外关于几丁质脱乙酰基酶的研究成果。
2014年3月-5月(分别进行克隆、表达、酶活等酶学性质测定)。
