1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献） 1.灵芝 灵芝[Ganoderma lucidum ( Leyss.ex Fr.)Ka rst.] (英文名为Reishimushroom) 又称瑞草、灵芝草，日本人称为万年茸，是灵芝属药、食两用真菌，世界各地均有分布，以热带和亚热带地区为多。在我国，灵芝药用已有2000多年的历史，其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药[1]。按照赵继鼎所著2000年版中国真菌志记载，中国灵芝科真菌共有4 属98种[2]，仅灵芝属(Ganoderma)就有76 种(灵芝组29 种，紫芝组26 种，树舌亚属20 种)之多。2000年版《中华人民共和国药典》收录了赤芝(Ganoderma lucidum) 与紫芝(G. sinense) 的干燥子实体作为新增中药材品种，灵芝药用价值首次得到正式承认。[3]2000 年美国出版的《美国草药药典和治疗概要》也把灵芝收录其中[4]。 灵芝所含化学成分众多，迄今国内外学者从灵芝子实体中已分离出150 余种活性成分[5]，大致可分为十大类，即：多糖、核苷、呋喃、甾醇、生物碱、氨基酸、蛋白质、三萜、油脂、有机锗和多种无机离子等。药理研究的试验证明，灵芝具有抗肿瘤，调节免疫系统、心血管系统的作用;保肝、抗衰老、消炎抗菌等功效。据调查，目前以灵芝为主要成分的市售产品达55 种[6]。这些产品不管是用于食疗或医疗，还是中成药或保健品，都具有较广阔的发展空间;灵芝的科研成果转化成商品的力度还较小，所以开发灵芝中成药仍有很大的潜力。 2.ATP合酶 ATP合酶又称F0F1-ATP酶, 是一个多亚基复合体, 广泛存在于生物界, 包括细菌的质膜、线粒体内膜和类囊体膜, 可以催化能源物质ATP的合成。 有关ATP合酶的分子学研究始于1960 年, Efraim Racker和他的同事报道了牛心线粒体中可溶因子的离析 [7]。Efraim等人还从叶绿体中离析出相似的因子, 其显示在线粒体和叶绿体ATP合酶的基本特征是一样的[8]。1966 年, AndreJagendorf的“酸-碱转换”实验，发现ATP合酶在F0内质子流与F1内ATP合成/水解两者间的能量交换中的作用是1997 年, Paul Boyer提出构象变化假说。3 种β亚基根据与核苷酸的亲和力不同, 依次发挥作用。该过程反复进行以不断合成ATP。这种由于亲和力的改变而不是ATP合成或水解的化学转化, 且伴随着能量的输入或输出的构象变化假说后来也被称为“结合变构机理”[9]。1996 年, Junge等还提出了一个旋转催化的模型。 通过前人的研究可知，ATP合酶主要由两部分组成:一是水溶性的蛋白复合体F1, 另外一个是疏水部分F0, 两者都是转动马达[10]。其中F1亚基由核基因编码, F0亚基由线粒体ATP6和ATP8基因以及核基因共同编码。该酶利用线粒体内膜两侧质子梯度差形成的势能, 通过结合改变机理旋转合成ATP, 也可逆水解ATP形成梯度差, 达到了很高的能量转化效率。其中ATP合酶b亚基位于F0疏水蛋白复合体，是ATP合酶的支架蛋白，研究显示在果蝇细胞中可以通过不同的培养条件可以通过ATP合酶b亚基改变果蝇体内ATP状态来调控果蝇寿命[11]。故，在生产与能量代谢方向上，ATP合酶的b亚基具有重要的研究意义。 3 乙酰辅酶A 乙酰辅酶A是辅酶A的乙酰化形式，它是脂肪酸的β-氧化及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用以ATP的合成。在胞内代谢网络中，乙酰辅酶A作为一个枢纽性的物质，连接着糖酵解、TCA循环、乙醛酸支路和乙酸代谢等代谢途径，同时参与
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| 了多种酶促反应，是合成多种生命物质的重要前体[12]，以乙酰辅酶A为前体的物质众多、以乙酰辅酶A为代谢中间产物的代谢途径也很多，随着高通量测序技术的不断发展，越来越多的酶反应信息及基因信息被挖掘出来，基于碳骨架重排的新反应设计和酶的定向设计可以模拟合成高效合成乙酰辅酶A及其衍生物的途径，并对生物体能量代谢循环的网络模型进行不断地完善，对其的研究具有广阔的前景。 4 本课题意义 灵芝作为东亚最广泛栽培的药用菇类之一，其拥有模式生物的许多鲜明特征, 例如, 世代周期短、子代多、基因组小、易于在实验室内培养和繁殖、能够进行遗传转化、对人体和环境无害等，适合实验所用。而在灵芝GAs代谢中乙酰辅酶A就是最初的底物 ADDIN EN.CITEEndNoteCiteAuthorZhao/AuthorYear2007/YearRecNum110/RecNumDisplayText[3,4]/DisplayTextrecordrec-number110/rec-numberforeign-keyskeyapp="EN" db-id="2w5pe2ds8veat4eda9c5p5zl5pxfvzssw50s"timestamp="1584257042"110/key/foreign-keysref-typename="JournalArticle"17/ref-typecontributorsauthorsauthorZhao,Mingwen/authorauthorLiang,Wanqi/authorauthorZhang,Dabing/authorauthorWang,Nan/authorauthorWang,Chenguang/authorauthorPan, Yingjie %J Journal ofMicrobiology/authorauthorBiotechnology/author/authors/contributorstitlestitleCloningand characterization of squalene synthase (SQS) gene from Ganodermalucidum/title/titlespages1106-1112/pagesvolume17/volumenumber7/numberdatesyear2007/year/datesurls/urls/record/CiteCiteAuthorShiao/AuthorYear1994/YearRecNum111/RecNumrecordrec-number111/rec-numberforeign-keyskeyapp="EN" db-id="2w5pe2ds8veat4eda9c5p5zl5pxfvzssw50s" timestamp="1584257103"111/key/foreign-keysref-typename="JournalArticle"17/ref-typecontributorsauthorsauthorShiao,M S/authorauthorLee, K R/authorauthorLin, LJ/authorauthorWang, C T %JChemInform/author/authors/contributorstitlestitleNaturalProducts and Biological Activities of the Chinese Medicinal Fungus Ganodermalucidum/title/titlesvolume25/volumenumber15/numberdatesyear1994/year/datesurls/urls/record/Cite/EndNote[13,14]，因此，本研究选用乙酰辅酶A作为灵芝能量代谢的指标。 ATP合酶作为能量代谢途径中的关键，其b亚基对合酶整体具有影响，并且真菌培养中不同的培养条件对真菌物质代谢具有有调节作用[15]， ADDIN EN.CITEEndNoteCiteAuthorZhang/AuthorYear2014/YearRecNum112/RecNumDisplayText[2]/DisplayTextrecordrec-number112/rec-numberforeign-keyskeyapp="EN" db-id="2w5pe2ds8veat4eda9c5p5zl5pxfvzssw50s"timestamp="1584257215"112/key/foreign-keysref-typename="JournalArticle"17/ref-typecontributorsauthorsauthorZhang,Jinming/authorauthorZhong,Jianjiang/authorauthorGeng, Anli %J ProcessBiochemistry/author/authors/contributorstitlestitleImprovementof ganoderic acid production by fermentation of Ganoderma lucidum withcellulase as an elicitor/title/titlespages1580-1586/pagesvolume49/volumenumber10/numberdatesyear2014/year/datesurls/urls/record/Cite/EndNote 因此本研究选取沉默ATP合酶b亚基来研究ATP合酶在灵芝中对乙酰辅酶a的影响。通过沉默灵芝ATP合酶观察对灵芝胞内乙酰辅酶A的影响来探究能量胁迫的状态下灵芝次级代谢的变化。
参考文献 [1]曾祥丽and包海鹰(2004)."灵芝三萜类成分与药理学研究进展."菌物研究2(1):68-77. [2]赵继鼎,张小青.中国真菌志·灵芝科[M].北京:科学出版社,2000. 195-192. [3]申进文,郭恒.灵芝及其产业发展前景[J].农家参谋,2003, (5): 19. [4]Sone N,Yoshida M, Hirata H, et al.Adenosine triphosphate synthesis byelectrochemical proton gradient in vesicles reconstituted from purifiedadenosine triphosphatase and phospholipids of thermophilicbacterium[J].Journal of Biological Chemistry, 1977, 252 (9) :2956-2960. [5]章灵华, 肖培根. 近十年灵芝研究的进展[J]. 西北药学杂志, 1993, 8(1): 31-35. [6]张晓云and杨春清(2006)."灵芝的化学成分和药理作用."现代药物与临床,21(4):152-155. [7]Daichi O,Ryota I, Hiroyuki N.Rotation and structure of F0F1-ATP synthase[J].Journal ofBiochemistry, 2011, 149 (6) :655-664. [8]PenefskyH S, Pullman M E, Datta A, et al.Partial resolution of the enzymes catalyzingoxidative phosphorylation.II.Participation of a soluble adenosinetolphosphatase in oxidative phosphorylation[J].Journal of BiologicalChemistry, 1960, 235 (235) :3330-3336. [9]Gresser MJ, Myers J A, Boyer P D.Catalytic site cooperativity of beef heartmitochondrial F1 adenosine triphosphatase—Correlations of initial velocity,bound intermediate, and oxygen exchange measurements with an alternatingthree-site model[J].Journal of Biological Chemistry, 1982, 257 (20):12030-12038. [10]柳昭明,冯红.ATP合酶的研究进展[J].天津科技,2016,43(05):34-39.
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2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题
1.研究目标
通过沉默灵芝atp合酶观察对灵芝胞内乙酰辅酶a的影响来探究能量胁迫的状态下灵芝次级代谢的变化。
3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1.研究方法 1.1菌株、质粒、试剂及菌株培养 1.1.1菌株、质粒、试剂 灵芝（G. lucidum）菌株G20由上海农科院提供。溶壁酶购自广东省微生物研究所、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司。所用到的抗生素均购自上海生工生物工程公司，其它试剂均为分析纯。 1.1.2 灵芝菌株培养 灵芝斜面菌株4°C保存，28°C在PDA液体培养基中培养6天用于基因组DNA和RNA的提取；灵芝菌株在PDA液体培养基中，150 r/min，28°培养7天用于三萜含量测定。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1.2 ATP合酶基因沉默 1.2.1总RNA的提取 参照说明使用 1.2.2 总RNA中DNA的消化 50 μL体系加如下试剂： 10×DNase I buffer 5 μL RNase-Free DNaseI 2 μL RNA酶抑制剂（40U U/μL） 0.5 μL RNA 25 μL ddH2O 17.5 μL
1.2.3 灵芝cDNA的制备（30 μL体系） 在上述离心管中配制下列反转录反应液： 5×M-MLV Buffer 6 μL dNTPs（each 10 mM） 3μL RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.5 μL M-MLV （RNaseHˉ） 0.5 μL 总体积 30 μL 1.2.4 PCR验证cDNA质量 选用Gl-Gpd-1和Gl-Gpd-2进行cDNA扩增，考察反转录后cDNA是否有gDNA污染： （1）PCR扩增体系为：
（2）PCR扩增程序为： 94 °C 5 min 94 °C 30 s 56 °C 30 s 28 cycles 72 °C 30 s 72 °C 5 min
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| 1.2.5质粒提取（碱裂解法）参照实验室前期方案 1.2.6 PCR、酶切与酶连体系 Taq 扩增体系及程序
PrimeSTAR 扩增体系及程序
酶切、酶连反应体系
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| 1.2.7 DH5α大肠杆菌质粒的细菌转化 参照实验室前期方案 1.2.8灵芝原生质体制备及脂质体转化 试剂：溶壁酶：1 g溶壁酶溶于50 mL 0.6 M甘露醇，过滤除菌。0.6 M甘露醇 ：10.93 g甘露醇定容到100 mL，灭菌 1.2.9 实时荧光定量PCR检测转化子沉默效率 （1）根据tor的cDNA全长序列设计引物，要求长度20bp左右，Tm值在55～65。C,产物大小在100～200 bp，引物结合模板特异性高，避免形成二聚体或发夹结构，为避免基因组的扩增，引物最好能跨越两个外显子。 （2）Q-RT PCR体系 REAL-time PCR扩增体系如下（20ul）： SYBR Green I Mix 10ul 上游引物（20uM） 0.5ul 下游引物（20uM） 0.5ul cDNA 1ul ddH2O 8ul 总体积 20ul （3）Q-RT PCR 程序：根据Real-time PCR的原理，采用PCR程序进行Q-RT PCR.通过溶解曲线考察基因扩増的特异性，防止出现非特异性扩増导致实验数据出现错误。 （4）Q-RT PCR 数据处理：根据Real-time PCR的原理，通过修正内标基因的ct值得到相应的Ct值。根据PCR反应检测得到的Ct值，按照比较Ct法计算每个样本中目标基因表达水平。 （5）统计分析方法：所有实验为三个重复，取它们的平均值作为相对表达量的最终结果。实验数据进行方差分析和数据比较。 1.3 乙酰辅酶A含量测定 （1） 根据表1设置适当的反应混合物 测定范围(0-1 n mole)
表1 反应混合物 （2）每个孔板中加入50 mL适当的反应混合物。 使用水平振动筛或通过管道搅拌均匀，并在37 摄氏度孵化10分钟，在孵化期间保护平板免受光照。 （3） 测量荧光强度(λex=535 /λem=587nm)
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| 1.4 灵芝胞内ATP的检测方法 使用碧云天公司生产的ATP检测试剂盒进行检测（货号S0026），本试剂盒原理采用的ATP与荧光素酶结合发光的荧光法进行检测。参照试剂盒使用说明。 注：本次实验使用样品中蛋白浓度进行定量。
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3.可行性分析 本实验室长期从事灵芝生长代谢研究，在灵芝多糖代谢、灵芝酸代谢等初级及次级代谢方面都一直有着很深的研究，而且都有相关SCI论文发表。实验也已查好文献，进行了初步的设计。 本人自大一以来一直认真学习理论知识，丰富自身的专业课知识，已完成微生物学、植物生理、生物化学、分子生物学等学科的学习。同时，我具备一定的实验动手能力和严谨求实的科研态度。
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4. 研究创新点
| 特色或创新之处
目前关于真菌中ATP对次级代谢相关研究并不多见，并且乙酰辅酶a作为各种代谢途径的最初底物，以及作为乙酰基影响基因乙酰化在真菌中的研究也不多见。本研究将乙酰辅酶a作为沟通灵芝ATP与灵芝GAs代谢之间的桥梁，来研究灵芝ATP在灵芝次级代谢中的作用，旨在为生产提供指导，也为真菌相关研究提供参考。
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| 研究计划及预期进展
2019.09-2019.10 熟悉实验室基本情况，查阅相关文献； 2019.10-2019.11 查阅相关文献，向师兄师姐学习基本实验操作，做一些预实验，进行实验条件的摸索； 2019.11-2020.03 培养灵芝G20菌株的野生型，构建ATP合酶b亚基基因RNAi沉默菌株。 2020.03-2020.04 测定各项生理指标，研究ATP合酶b亚基基因沉默后对灵芝ATP、乙酰辅酶A以及GAs的影响。 2020.04-2020.05 整理实验数据，撰写毕业论文，准备答辩。
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5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展
2019.09-2019.10 熟悉实验室基本情况，查阅相关文献； 2019.10-2019.11 查阅相关文献，向师兄师姐学习基本实验操作，做一些预实验，进行实验条件的摸索； 2019.11-2020.03 培养灵芝G20菌株的野生型，构建ATP合酶b亚基基因RNAi沉默菌株。 2020.03-2020.04 测定各项生理指标，研究ATP合酶b亚基基因沉默后对灵芝ATP、乙酰辅酶A以及GAs的影响。 2020.04-2020.05 整理实验数据，撰写毕业论文，准备答辩。
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