1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题的意义
1.1研究植物木质纤维素的资源化利用具有重要前景
植物木质纤维素（lignocellulose）是地球上一种含量最为丰富的可再生和可持续发展的生物能源，主要由占25%木质素、45%纤维素、30%半纤维素三大部分所组成。木质纤维素经由转化可成为工业生产中重要的能源燃料和药品试剂；通过生物、化学及物理等方法可用于制造各种生物材料；还可作为食用菌的栽培基料。而纤维素是植物细胞壁的主要成分[1]，是由葡萄糖脱水，通过β-1，4葡萄糖苷键[2]连接形成的直链聚合体，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。因为天然纤维素外围常包有木质素，且具有水不溶性的高度结晶结构，对于其水解并利用较为困难。
2. 研究的基本内容和问题
1研究目的及内容
在香菇菌种液体培养过程中添加外源的乙酸，测定香菇纤维素酶的表达量及活性的影响。在乙酸显著诱导增强香菇纤维素酶的表达量及活性的前提下，通过均匀设计实验对乙酸的诱导条件进行优化，观察该浓度下是否对香菇的生长有影响，从而筛选出最适的乙酸浓度。为研究乙酸对香菇纤维素酶的调控机理，在一定的乙酸浓度区间内测定香菇胞内关于ros和ca2 的浓度，从而分析乙酸对香菇细胞内ros和ca2 的影响。通过q-rt pcr技术考察乙酸在香菇纤维素酶生物合成途径中已知酶基因的转录水平的变化，最终根据实验结果初步分析乙酸对于香菇纤维素酶代谢的调控作用机理，为香菇纤维素酶资源化打下科研基础。
2拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
实验材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和质粒
pMD19T、大肠杆菌E.coli DH5α、pGlcoi（pmi）质粒、香菇菌株。
1．1．2 培养基
LB培养基：
酵母粉10 g、蛋白胨5 g、NaCl粉末 10 g，定容1 L，每100 mL分装后115℃灭菌30 min（如需调制固体培养基，将每100mL液体培养基加入1.5 g琼脂糖分装）。
CYM培养基：
10%麦芽糖、20%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.05%七水硫酸镁、0.46%磷酸二氢钾加去离子水溶解，pH调至7，每100 mL分装后115℃灭菌30 min（如需调制固体培养基，将每100 mL液体培养基加入1.5 g琼脂糖分装）。
PDA培养基：
去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、定容1 L，pH自然，每100 mL分装后115 ℃灭菌30 min（如需调制固体培养基，将每100 mL液体培养基加入1.5g琼脂糖分装）。
1．1．3 试剂与溶液
试剂：PCR相关试剂、冰醋酸、95%乙醇、维生素C等。
1．1．4 主要仪器设备
分析天平、种子破碎机、摇床、高压蒸汽灭菌锅、PCR仪、qRT-PCR仪、荧光显微镜、超声波清洗仪、超净工作台等。
1．2 方法
1．2．1 菌株培养
固体平板培养香菇菌株：从4 °C冰箱取出PDA固体斜面保种管，用接种针转接至PDA固体平板上，于25 °C培养箱培养7天活化菌株。
液体发酵培养方法：用打孔器对活化好的菌丝进行打孔，转接8-10个菌块加入PDA液体培养基中，于25 °C培养箱培养静置3天后于25 °C摇床150 r/min，培养13天，此时香菇长成一左右光滑球形菌团。
大肠杆菌DH5α使用LB培养基进行培养，DH5α菌株保存在含20%甘油中，并在-70°C长期保存。
1．2．2 不同浓度乙酸诱导香菇菌丝体
为了探讨不同浓度的乙酸对香菇纤维素酶生物影响，设计加入到基础培养基中的乙酸梯度浓度为5~10 mM，并用盐酸调节pH平衡。并以仅加入蒸馏水和盐酸的培养基为对照。所有的实验处理都为三个重复，取它们的平均值作为测定香菇纤维素酶活性的最终结果。
1．2．3 香菇纤维素酶相关基因的表达
RNA提取
（1）将经过酸缸浸泡的研钵，煮沸30min。液氮预冷研钵，将样品置于研钵中，加入液氮研磨成粉。取半勺粉末移入含1 mL RNAiso Plus的离心管中，剧烈颠倒混匀，冰上静止5min；
（2）12000 rpm，4 °C，离心10 min；
（3）取约600 L上清液至1.5 mL离心管中，加入400L事先预冷的氯仿，剧烈震荡至粉红色，冰上静止10 min；
（4）12000 rpm，4 °C、离心15 min；
（5）取约150 L上清液，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静止5-10 min；
（6）12000 rpm，4 °C、10 min，出现沉淀；
（7）小心弃上清，沿管壁加入500 L 75 % 乙醇，轻微颠倒洗涤沉淀；
（8）12000 rpm，4 °C、5 min，弃上清，瞬离，用枪吸除剩余液体；
（9）静置10min，干燥RNA沉淀，加入30 L RNase-free ddH2O溶解。电泳检测RNA的完整性。RNA样品存放于-70 °C冰箱中保存。
Q-RT PCR(AMB)
（1）扩增体系
| 2x SYBR Green | 10 μL |
| cDNA | 1 μL |
| 引物1 | 1 μL |
| 引物2 | 1 μL |
| ddH2O | 7 μL |
| 总体积 | 20 μL |
（2）PCR扩增程序为：
| 95 °C | 10 min |
| 95 °C | 15 s |
| 60 °C | 60 s |
| 95 °C | 15 s |
| 60 °C | 15 s |
| 逐步升温到95 °C | 20 min |
| 10 °C | Hold |
RNA反转录
（1）在离心管中加入以下反应体系：
RNA 6 μL
AccuRT Reaction Mix(4×) 2 μL
（2）在42 °C下反应2min；
（3）随后在离心管中加入以下反应体系：
RNA 6 μL
AccuRT Reaction Mix(4×) 2 μL
（2）在42 °C下反应2min；
（3）随后在离心管中加入以下反应体系：
AccuRT Reaction stopper(5×) 2μL
5×Au-in-one RT Master Mix 4 μL
Nuclease-free H2O 6 μL
总体系 20μL
（4）在25 °C下反应10 min，42°C孵育反转录15 min；
（5）85°C加热5 min
（6）4°C冰箱中保存样品
RNA扩增片段
反应体系：
cDNA 1 μL
rTaq 0.2 μL
dNTP 2 μL
10×buffer 2.5 μL
PCR forward primer 1 μL
PCR reverse primer 1 μL
ddH2O 17.3 μL
总体系 25μL
1．2．4 香菇纤维素酶活性测定
纤维素酶活性主要用CMCNa来表征，操作过程尽量在冰上进行，酶活为单位（IU/mL）定义为每毫升酶液每分钟释放1 μmoL还原糖所相当的酶量。
（1）取对应的1%（w/v）CMCNa溶液18 μL于PCR管，PCR管置于冰上。
（2）加入18uL稀释好的预冷的酶液，充分混匀置于冰上，设置不加酶液的空白对照。
（3）将PCR管设置于PCR仪上，50℃反应30min。（反应时间）
（4）反应结束后迅速将PCR管插入冰上，加入30uL的DNS，充分混匀，对照组加入DNS后还要加18uL对应的酶液。
（5）PCR管置于设置好的PCR仪上，99°C反应10min。
（6）反应结束后PCR管离心，取40uL的反应液加入到96孔板，再加入160uL蒸馏水，混匀后在540nm下读吸光值。
（7）实验组值减去对照组值，做三组平行实验计算平均值，根据葡萄糖标曲，计算酶活。
在 pH 4.8 的柠檬酸buffer（0.05 M）中，加入酶液 0.5 mL， 然后加入 0.5 mL 2%（W/V） 中等粘度型羧甲基纤维素钠（CMC-Na），50 °C 反应 30 min。
底物空白：0.5 mL CMC-Na 0.5 mL 柠檬酸
buffer酶液空白：0.5 mL 柠檬酸 buffer 0.5 mL 酶液
1 mg glucose=0.37 units/mL
葡萄糖标准曲线的制定
分别取 1.00 mg/mL 葡萄糖标准液 10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL 于 100 mL 容量瓶中， 加水定容。以 1 mL 蒸馏水作为空白对照， 再分别取上述各溶液 1 mL于 100 mL 具筛玻璃罐中， 加入 2 mL DNS 快速摇匀，于沸水中水浴加热 5 min， 再用自来水冷却至室温， 测定 540 nm下的吸光度。
DNS配方
3，5二硝基水杨酸 6.3g
NAOH 21g
酒石酸钾钠 185g
苯酚 5g
无水亚硫酸钠 5g
蒸馏水 1000 ml
置于棕色瓶中备用，室温放置七天后使用
柠檬酸buffer(0.05M pH4.8)
一水柠檬酸 210g
ddH2O 750ml
NAOH 调pH到4.8(50-60g)
定容至1000 ml
1．2．5 胞内ROS检测
液体发酵菌丝胞内ROS的染色方法如下：收集不同处理的液体发酵培养的菌丝，去除培养基，挑取适量菌丝球置于0.5 mg/mL NBT染色液中孵育0.5-1.0ｈ左右，待颜色变蓝（NBT）后倒去染液，将菌丝球悬浮于水中，拍照记录。
平板菌丝胞内ROS的荧光检测方法如下：采用DCHF-DA（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate）荧光探针结合H2O2，用激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP2）进行观察。将无菌盖玻片斜插入菌丝边缘，待菌丝爬上盖玻片时，菌丝在10 μM DCHF-DA中避光孵育15min，用10 mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗涤2-3次；置于激光共聚焦显微镜下观察。荧光强度通过Leica系统自带软件进行统计分析，荧光探针结合H2O2，用激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP2）进行观察。将无菌盖玻片斜插入菌丝边缘，待菌丝爬上盖玻片时， 菌丝在10μM DCHF-DA中避光孵育15min，用10mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）洗涤2-3次；置于激光共聚焦显微镜下观察。荧光强度通过Lecia系统自带软件进行统计分析。
1．2．6 钼酸按法测定胞内H2O2含量
过氧化氢（H2O2）可以与钼酸反应产生一种络合物，在紫外分光光度计405nm处测定其吸光值，通过吸光值间接算出H2O2含量。
实验操作具体方法如下：
（1）收集不同处理的新鲜菌丝，称取大约1g，加入800 μL 0.05 M磷酸钠缓冲液（pH7.4）后于冰上研磨，研磨均匀后将匀浆液转移至1.5mL离心管，4°C，12000rpm离心5min，转移上清；
（2）试剂盒测定H2O2，依次加入反应物:
| 试剂 | 空白（mL） | 标准（mL） | 待测样品（mL） |
| 试剂一（37°C预热） | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| ddH2O | 0.5 | — | — |
| 163 mMH2O2标准品 | — | 0.1 0.4 ddH2O |
|
| 待测样品 | — | — | 0.5 |
| 试剂二 | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
（3）反应液混匀后，立即使用紫外测定仪测定405nm的吸光值，空白调零；
（4）总蛋白含量测定，反应体系如下，混匀反应液，待反应５min后测定595nm的OD值，根据标准曲线换算出样品中的蛋白含量
| 试剂 | 空白（mL） | 标准（mL） | 待测样品（mL） |
| 考马斯亮蓝 | 5 | 5 | 5 |
| ddH2O | 1 | 用于制定标准曲线 | 0.95 |
| 乳清酸蛋白标准品 | — | （总体积1mL） | 0.05 |
| 待测样品 | — | — | 0.5 |
（5）计算公式：细胞中H2O2含量(mmol/g)=(样品OD值/标准品OD值)×标准品浓度(mmol/L)/样品蛋白浓度(g/L)
1．2．7 胞内Ca2 荧光检测
Flu-3AM法检测胞内钙离子浓度
胞内钙离子含量检测用钙离子荧光探针Flu-3AM法测定。Flu-3AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Flu-3AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。
Flu-3AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Flu-3，从而被滞留在细胞内。Fluo3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。取爬有菌丝的盖玻片，加入适量10 μM Flu-3AM 溶液，使其完全覆盖菌丝体。然后在37°Ｃ下避光孵育60 min进行荧光探针装载，随后用去离子水适当洗涤。洗漆后再在３７°Ｃ下避光孵育30分钟。随后用激光共聚焦显微镜（Leica，TCS SP2），在488 nm激发光，505-530 nm检测光观察荧光。绿色荧光强度越高代表胞内钙离子浓度越高。
软件量化分析钙离子浓度
打开Leica Confocal Software(LCS Lit)激光共聚焦分析软件，加载所需要分析的文件，依次运行Quantify-Quantification Tools-Histogram-Generate Report，将导出文件中荧光强度信号数值进行进一步统计学分析。
技术路线
4. 研究创新点
现阶段国内外关于香菇纤维素酶研究仍较少，为了适应现阶段对于纤维素酶工业化资源化的需求，提高纤维素的利用效率，寻找合适、安全、成本低廉的诱导剂来提升纤维素酶的活性，现已成为这块领域的研究热点之一。而乙酸作为食用醋的主要成分，在具备成本低廉、易大量制取优点的同时，其安全性也得以保障，若能成为可靠的诱导剂，这在香菇纤维素酶的工业化发展和资源利用方面具有重要意义。
5. 研究计划与进展
2019.09-2019.11 乙酸处理香菇菌丝体，筛选乙酸最适浓度；建立q-rtpcr体系
2019.12-2020.01 确定合成途径关键酶基因；测定乙酸对ros与ca2 与酶活影响
2020.03-2020.06 重复实验，分析乙酸对香菇纤维素酶的代谢调控
